Polska jest pionierem w produkcji gęsi w Europie. Przyjmuje się, że populacja gęsi w Polsce wynosi około 6 milionów sztuk. Szczególnie niebezpieczną, a jed-nocześnie najczęściej występującą chorobą wirusową u gęsi jest choroba Derz-sy’ego (DD – Derzsy Disease), wywoływana przez parwowirus z rodziny
Parvo-viridae [1]. Podlega ona obowiązkowi rejestracji i stanowi poważny problem
epizootyczny oraz ekonomiczny w wielkostadnej produkcji gęsi. Wirus powodu-je masowe padnięcia gąsiąt, sięgające nawet 100%, znaczne spadki wagowe, a tak-że ubytki w upierzeniu.
Dotychczas do wykrywania wirusa choroby Derzsy’ego stosowana była głównie technika PCR oraz real time PCR [2, 3, 6], jednak wymagają one zastosowania dro-giego sprzętu i pochłaniają stosunkowo dużo czasu (nawet 4–5 godzin). W reakcji LAMP (loop mediated isothermal amplification) amplifikacja DNA zachodzi w wa-runkach stałej temperatury w prostej łaźni wodnej, z zastosowaniem 2–3 par star-terów komplementarnych do odpowiedniego genu. Możliwość odczytywania wyni-ków istnieje nawet po 30 minutach. W przypadku wyniku dodatniego widoczna jest w promieniach UV silna fluorescencja [4, 5].
Celem przeprowadzonych badań jest opracowanie metody LAMP do usprawnie-nia diagnostyki choroby Derzsy’ego i skróceusprawnie-nia czasu oczekiwausprawnie-nia na wynik.
Materiał i metody
Próbki. Materiał do badań stanowiło 27 próbek pochodzących od gęsi z kliniczny-mi objawakliniczny-mi choroby Derzsy’ego. Z wątrób i serc chorych ptaków wykonano 20% homogenaty, a następnie izolowano całkowite, komórkowe DNA (Qiagen).
szczep standardowy. Standardowy szczep 24/03 (GenBank accession number – GQ 468411) został wyizolowany od gęsi w wieku 2,5 tygodni, z klinicznymi obja-wami DD. Szczep ten namnażano w hodowli fibroblastów 14-dniowych zarodków gęsich (GEF-goose embryo fibroblasts). Codziennie przez 7 dni obserwowano ho-dowlę, oceniając efekt cytopatyczny (CPE cytophatic effect).
Pcr. Reakcję amplifikacji przeprowadzono przy użyciu starterów komplemen-tarnych do genu VP3: GPV F 5’-TTTATGGCAGAGGGAGGAGGC – 3’, GPV R 5’ – GGGTTACAGATTTTGAGTTAG – 3’, a następnie produkty reakcji izolowano w 2% żelu agarozowym i obserwowano pod lampą UV. Obecność produktów wiel-kości 1604 pz świadczyła o pozytywnym wyniku.
LaMP (loop mediated isothermal amplification). Do reakcji użyto 3 par star-terów komplementarnych do genu VP3 (tab. 1). Kontrolę dodatnią stanowił szczep 24/03, natomiast ujemną DNA wyizolowane z niezakażonej hodowli GEF. Miesza-nina reakcyjna zawierała polimerazę Bsm oraz barwnik SYBR Green lub Gel Red. Inkubacje przeprowadzono w łaźni wodnej, stosując różne temperatury: 55, 58, 60, 63, 65°C oraz odmienny czas: 20, 30, 60, 120 min. Po reakcji do prób dodano barw-nik SYBR Green lub Gel Red, a wybarw-niki odczytywano pod lampą UV, obserwując zie-loną (SYBR Green) lub pomarańczową (Gel Red) luminescencję w przypadku obec-ności materiału genetycznego DDV bądź jej brak w przypadku prób ujemnych. Aby potwierdzić reakcję, dokonano rozdziału elektroforetycznego otrzymanych pro-duktów. Charakterystyczna drabinka w żelu agarozowym widziana pod lampą UV świadczyła o wyniku pozytywnym.
Tabela 1. Sekwencje zastosowanych starterów
Typ primerów Sekwencja
F3 forward outer 5’-GGTTTGGCAGAACAGGGATA-3’
B3 backward outer 5’-GCCCGTAGAGTACTGGGTTA-3’
FIP forward inner 5’- GGCCAAATCCTCCGAGATTCGGTTTTTGGGGCAAAAATACCGAAGA-3’
BIP backward inner 5’-CAATCCACCACCGCAGGTGTTTTTCCACTTCTGGTGCACGTATT-3’
LF loop forward 5’-AAGGATGGAATTTACCATCAG-3’
LB loop backward 5’-ATCAAGAATACACCAGTGCC-3’
specyficzność. Specyficzność reakcji sprawdzano przy zastosowaniu DNA: pta-siego adenowirusa typ-1 szczep CELO (FadV-1), gępta-siego cirkowirusa (GoCV) oraz poliomawirusa (GHPV) oraz DNA wyizolowanego z niezakażonej hodowli fibro-blastów gęsich (GEF).
czułość. Czułość reakcji określano poprzez zastosowanie pięciu 10-krotnych rozcieńczeń DNA izolowanego ze szczepu standardowego 24/03 o mianie od 100 do 0,001 TCID50 .
Wyniki i dyskusja
LaMP. Pozytywne wyniki widoczne jako zielona lub pomarańczowa luminescencja obserwowane były przy stosowaniu 60, 63 i 65°C przez 30, 60 i 120 min inkubacji. Następujące parametry uznano za optymalne do przeprowadzenia reakcji: 30 min inkubacji w temperaturze 60°C. Wyniki zostały potwierdzone przez elektroforezę otrzymanych produktów.
czułość i specyficzność. Obecność luminescencji i charakterystycznej drabinki w żelu agarozowym widoczna była tylko w próbie zawierającej DDV, w pozostałych nie obserwowano fluorescsencji pod lampą UV. Metoda pozwoliła na wykrywanie 0,1 TCID50 szczepu DDV.
Porównanie metody LaMP i Pcr z zastosowaniem materiałów z przypadków terenowych. 27 prób terenowych z podejrzeniem choroby Derzsy’ego przebadano, stosując metodę LAMP i PCR. Metodą LAMP wykryto materiał genetyczny DDV w 16 próbach (59,2%), natomiast metodą PCR w 15 (55,5%) (ryc. 1).
Ryc. 1. LAMP. Próbki pozytywne: 3–9, 11–14, 22–23, oraz 25–27. Próbki negatywne 1–2, 10, 15–21 oraz 24
Przeprowadzone badania własne pozwoliły na opracowanie LAMP jako szybkiej i dokładnej metody do wykrywania parwowirusów gęsich. Do przeprowadzenia te-stu wymagane jest użycie polimerazy Bsm oraz trzech par starterów, komplemen-tarnych do genu VP3 wirusa DD, a także łaźnia wodna i lampa UV do wizualizacji wyników. Ocena wyników jest możliwa już po 30 minutach w temperaturze 60°C. Specyficzność reakcji została potwierdzona przez wykorzystanie wirusów należą-cych do innych grup systematycznych (GCV, FadV, GHPV, MDV). Natomiast czu-łość została sprawdzona poprzez zastosowanie różnych koncentracji wirusa DD od 100 do 0,01 TCID50 i ustalono, że wynosi 0,1 TCID50
Yang i wsp. [7] zastosowali LAMP do diagnostyki choroby Derzsy’ego. W ich badaniach optymalne wyniki uzyskiwano po 20 minutach w temperaturze 65°C. Autorzy ponadto wykazali, że czułość i specyficzność LAMP jest porównywalna z FQ-PCR. W naszych badaniach, stosując PCR, wykrywano 1,0 TCID50 DDV, natomiast LAMP wykrywał 0,1 TCID50 tego wirusa. Obecność materiału gene-tycznego DDV za pomocą PCR wykazano w 15 z 27 przebadanych próbkach terenowych (55,5%), natomiast LAMP wykrył jego obecność w 16 próbkach (59,2%).
Podsumowując, opracowana metoda LAMP pozwala na szybkie wykrywanie omawianego wirusa nawet przez laboratoria, w których za względów ekonomicz-nych zastosowanie inekonomicz-nych metod jest zbyt kosztowne i skomplikowane. Metoda ta jest konkurencyjna w stosunku do metod wirusologicznych, serologicznych, a nawet molekularnych. Nie wymaga zastosowania specjalistycznego (drogiego) sprzętu ani dużego doświadczenia osoby wykonującej badanie. Technika ta może znacznie usprawnić diagnostykę choroby Derzsy’ego oraz skrócić czas oczekiwa-nia na wyniki.
Piśmiennictwo
[1] Brown K.E., Green S.W., Young N.S., 1995. Goose parvovirus – an autonomus member of the Dependovirus genus. Virology, 210, 283–291.
[2] Huang C., Cheng A.C, Wang M.S., Liu F., Han X.F., Wang G., Zhou W.G., Wen M., Jia R.Y., Guo Y.F., Chen X.Y., Zhou Y., 2004. Development and application of PCR to detect goose parvovirus. Vet. Sci. China, 9, 54–60.
[3] Limn C.K., Yamada T., Nakamura M., 1996. Detection of goose parvovirus genome by polymerase chain reaction: distribution of goose parvovirus in Muscovy ducklings. Vi-rus Res., 1, 162–172.
[4] Nagamine K., Watanabe K., Ohtsuka K., Hase T., Notomi T., 2001. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenaturated template. Clin. Chem., 47, 1742–1743.
[5] Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T., 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res., 28, 63. [6] Yang J.L., Cheng A.Ch., Wang M.S., Pan K.Ch., Li M., Guo Y.F., Li Ch.F., Zhu D.K., Chen
X.Y., 2009. Development of a fluorescent quantitative real time PCR assay for the detec-tion of goose parvovirus in vivo. Virology J., 6, 142 doi: 10.1186/1743–422X-6–142. [7] Yang J.L., Yang R., Cheng A.C., Wang M.S., Fu L.Z., Yang S.Q., Zhang S.H., Yang L., Xu
Z.Y., 2010. A simple and rapid method for detection of goose parvovirus in the field by loop-mediated isothermal amplification. Virology J., 7, 14 doi: 10.1186/1743–422X-7–14.
Katarzyna Bobusia, Andrzej Gaweł Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu