Oporność na antybiotyki β-laktamowe
Celem antybiotyków β-laktamowych są białka wiążące penicylinę – PBP (ang. Peni-cylin Binding Protein). Enterokoki posiadają naturalną, wrodzoną oporność na an-tybiotyki β-laktamowe, która związana jest z ich niskim powinowactwem do białek
wiążących penicyliny – PBP5 u E. faecium, PBP4 u E. faecalis [47]. Ta wrodzona opor-ność różni się w zależności od rodzaju β-laktamów. Penicyliny mają największą ak-tywność w stosunku do enterokoków, nieco mniejszą aktywnością cechują się karba-penemy, natomiast najmniejszą cefalosporyny.
Inny mechanizm oporności związany z białkami wiążącymi penicylinę obserwo-wany jest czasem w przypadku bakterii nabywających, w porównaniu ze szczepami dzikimi, bardzo wysoki poziom oporności na antybiotyki β-laktamowe. U niektó-rych bakterii oporność na antybiotyki β-laktamowe jest związana z nadprodukcją białek powierzchniowych PBP5. Przykładem tego typu oporności jest nadproduk-cja PBP5 przez niektóre penicylinooporne szczepy E. hirae. Gen pbp5 E. hirae znaj-duje się pod kontrolą genu psr [32]. Inaktywacja psr wskutek delecji lub mutacji pro-wadzi do zwiększenia liczy kopii PBP5, a zatem do wysycenia wszystkich cząsteczek tego białka niezbędne jest większe stężenie antybiotyku.
Niektóre enterokoki posiadają zupełnie inny, występujący zdecydowanie rza-dziej, mechanizm oporności na β-laktamy. Polega on na syntezie przez drobno-ustroje β-laktamaz – enzymów hydrolizujących pierścień β-laktamowy w cząstecz-ce antybiotyku. Zhydrolizowany w ten sposób antybiotyk zostaje unieczynniony i nie wpływa hamująco na funkcje enzymatyczne powierzchniowych białek PBP. Bakterie zatem mogą swobodnie syntetyzować peptydoglikan. Gen warunkują-cy ekspresję β-laktamaz ulokowany jest na plazmidzie i występuje zazwyczaj z ge-nem kodującym oporność na gentamycynę. β-laktamazy wytwarzane są najczęściej w niewielkiej ilości. Zatem przy niskiej liczebności bakterii – wartości MIC dla pe-nicyliny i ampicyliny mogą plasować się na poziomie odpowiadającym bakteriom wrażliwym na działanie tych antybiotyków [36, 37, 38].
Oporność na inhibitory III etapu syntezy mureiny – oporność na glikopeptydy
Najważniejszym procesem zapewniającym bakteriom oporność na glikopeptydy jest osłabienie wiązań cząsteczki antybiotyku z receptorami zlokalizowanymi w ścia-nie komórkowej. Enterokoki zarówno podatne, jak i oporne na działaścia-nie wankomy-cyny posiadają na zewnątrz błony komórkowej specyficzne kompleksy składające się z mureiny i pentapeptydów. Stanowią one docelowe struktury, z którymi wią-żą się antybiotyki glikopeptydowe. Wspomniane wcześniej pentapeptydy składają się z tripeptydowych prekursorów, do których dołączane są dipeptydy. W przypad-ku szczepów wrażliwych na wankomycynę jest to D-alanylo-D-alanina (D-Ala-D--Ala). Natomiast u bakterii opornych na wankomycynę (VRE) następuje zamiana końcowego aminokwasu D-alaniny na D-serynę (D-ser) lub D-mleczan (D-lac). Substytucja D-alaniny na D-serynę skutkuje zmianami w konformacji wiązań z czą-steczkami antybiotyku, co znacznie je osłabia. Jeśli natomiast w miejsce D-alaniny przyłączy się D-mleczan, dochodzi do redukcji liczby wiązań z wankomycyną. Do-wiedziono, że szczepy zawierające dipeptydy D-Ala-D-Ser są wrażliwe na
teikopla-ninę i wykazują oporność na niskie stężenie wankomycyny. Natomiast w przypadku gdy prekursory peptydoglikanu zawierają dipeptydy D-Ala-D-Lac, charakteryzują się wysoką opornością na działanie wankomycyny [42]. W ten sposób zorganizowa-ne struktury biorą udział w procesie syntezy ściany komórkowej. W wyniku związa-nia się wankomycyny z cząsteczką pentapeptydu dochodzi do jego zablokowazwiąza-nia, co w konsekwencji prowadzi do zatrzymania syntezy ściany komórkowej. W drugim przypadku wiązanie się antybiotyku do prekursora peptydoglikanu jest ograniczo-ne, w efekcie czego może dochodzić do syntezy ściany komórkowej pomimo obec-ności wankomycyny.
Nabywanie przez drobnoustroje oporności na antybiotyki jest procesem złożonym i długotrwałym. Wytworzenie oporności na wankomycynę również powstało w wy-niku stopniowego nabywania od różnych gatunków bakterii odpowiednich genów. W przypadku oporności na glikopeptydy najważniejszą rolę pełni kompleks genów, które zorganizowane są w tzw. operon oporności na wysokie stężenia wankomy-cyny. W wyniku ekspresji tych genów powstają białka, które są zdolne do syntezy D-mleczanu. Powstają również proteiny mogące rozcinać dipeptydy D-Ala-D-Ala, przez co umożliwiają dołączenie się D-seryny lub D-mleczanu [42].
Pod względem oporności na wankomycynę enterokoki nie są jednorodne fenoty-powo ani genotyfenoty-powo. Na podstawie poziomu oporności na wankomycynę, moż-liwości jej indukowania oraz oporności krzyżowej na wankomycynę i teikoplani-nę wyróżnia się wśród enterokoków VRE siedem klas fenotypowych, nazywanych: VanA, VanB, VanC, VanD, VanE, VanG [14] i VanL [10]. W obrębie typów VanB i VanC wyodrębniono jeszcze po trzy podtypy. Są to odpowiednio: VanB1, VanB2 i VanB3, a także VanC1, VanC2 i VanC3. W praktyce klinicznej największe znacze-nie mają fenotypy VanA oraz VanB.
oporność typu a (Vana). Ta nabyta indukcyjna oporność na wysokie stęże-nia wankomycyny (MIC 64–100 μg/ml) i teikoplaniny (MIC 16–512 μg/ml) wy-stępuje najczęściej u gatunków E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. raffinosus, E.
hi-rae, E. avium, E. casseliflavus, E. mundtii, ale także E. gallinarum [13, 27]. Końcowy
fragment D-Ala-D-Ala jest zamieniony na dipeptyd D-Ala-D-Lac, co uniemożliwia wiązanie antybiotyku, nawet przy jego bardzo wysokich stężeniach. Przenoszenie genów odbywa się poprzez transpozon Tn1546 obecny na plazmidzie lub chromo-somie [14].
oporność typu B (VanB). Fenotyp VanB cechuje się indukowalną opornością na wankomycynę na różnym poziomie (MIC 4–1024 μg/ml) przy zachowanej wrażli-wości in vitro na teikoplaninę (MIC 0,5–1 μg/ml). Dipeptyd D-Ala-D-Ala zostaje zamieniony na D-Ala-D-Lac, podobnie jak w fenotypie VanA. Występuje u gatun-ków E. faecium, E. faecalis oraz E. durans i E. gallinarum [29, 52]. Na podstawie róż-nic w sekwencji DNA genów kodujących ligazę VanB wyróżniono w obrębie tego fe-notypu 3 podtypy: VanB1, VanB2, VanB3 [13, 15]. Nie wykazano natomiast związku
pomiędzy występowaniem danego podtypu a poziomem oporności na wankomy-cynę i teikoplaninę.
oporność typu c (Vanc). To naturalna oporność występująca u ruchliwych gatunków enterokoków: Enterococcus gallinarum (vanC1) [29], E. casseliflavus (vanC2) i E. flavescens (vanC3) [39], która jest regulowana zarówno indukcyjnie, jak i konstytutywnie. Obok fragmentów D-Ala pojawiają się peptydy D-Ala--D-Ser, w ilości 1:3. Ten fenotyp charakteryzuje się opornością na niskie stężenia wankomycyny (MIC 4–32 mg/l) oraz wrażliwością na teikoplaninę (MIC <1 mg/l).
oporność typu d (Vand). Oporność ta jest wynikiem wytwarzania prekurso-rów mureiny zakończonych D-alanylo-D-mleczanem, lecz różne jest tło genetycz-ne opisanych dotychczas szczepów [17]. W przypadku Enterococcus faecium BM439 stwierdzono insercję pięciu par zasad w genie strukturalnym ligazy, natomiast w E. faecium BM4416 mutacja była wynikiem insercji IS19 w genie ddl. Enterokoki VanD charakteryzują się konstytutywną opornością na stosunkowo duże stężenia wankomycyny (MIC 64 µg/ml) oraz na małe stężenia teikoplaniny (MIC 4 µg/ml).
oporność typu e, g i L (Vane, Vang i Van L). VanE to nabyty typ oporno-ści stwierdzony u szczepu BM4405 Enterococcus faecalis, wykazujący niski stopień oporności na wankomycynę (MIC 16 µg/ml) i wrażliwość na teikoplaninę. Szczep ten wytwarza prekursory mureiny zakończone D-Alanylo-D-Seryną [1]. Naby-ty fenoNaby-typ VanG charakteryzuje się opornością na niski poziom wankomycyny (MIC 16 mg/ml) ale wrażliwością na teikoplaninę (MIC 0,5 mg/ml). Oporność ta jest wynikiem wytwarzania prekursorów mureiny zakończonych D-ala-D-ser [34]. Fenotyp VanL stwierdzono u szczepu Enterococcus faecalis N06–0364, który cechu-je się opornością na wankomycynę na poziomie MIC 8 µg/ml. Oporność ta cechu-jest wy-nikiem wytwarzania prekursorów mureiny zakończonych D-Ala-D-Ser. Gen vanL jest podobny w strukturze do operonu vanC, jednakże racemaza serynowa VanT kodowana jest przez dwa oddzielne geny: vanTmL (membrane binding) i vanTrL (racemase) [10]. Fenotypy VanD, VanE, VanG oraz VanL występują niezmiernie rzadko. W Polsce dotychczas nie odnotowano szczepów klinicznych o tych fenoty-pach oporności.