Diagnostyka molekularna

Diagnostyka patogenów roślinnych przeprowadzana na podstawie cech morfolo-gicznych, fizjologicznych czy biochemiczny, chociaż w odniesieniu do wielu patogenów wystarczająca, stanowi metodę czasochłonną, trudną i jest obarczona wysokimi kosztami. Do postawienia poprawnej diagnozy, wymaga również wieloletniego doświad-czania diagnosty. Co więcej, w wypadku patogenów nie rozmnażających się genera-tywnie, pula cech możliwych do oceny jest bardzo ograniczona, gdzie na wartość ocenianych cech wpływają również warunki środowiskowe [9].

Techniki biologii molekularnej umożliwiają przeprowadzenie precyzyjnej diagnozy na roślinach z widocznymi symptomami chorobowymi (w późnym stadium infekcji) ale przede wszystkim na etapie bezobjawowym, umożliwiając tym samym minima-lizację strat spowodowanych przez patogeny. w jakości i ilości plonu.

Badania molekularne, specyficzne dla danego organizmu/patogena, są oparte o technikę cyklicznej amplifikacji kwasu deoksyrybonukleinowego z wykorzystaniem polimerazy tzw. PCR (oraz jej modyfikację).

Reakcja łańcuchowa polimerazy polega na wielokrotnej amplifikacji konkretnego odcinka materiału genetycznego [10]. Amplifikacja odbywa się z wykorzystaniem:

 „Starterów” które stanowią – krótkie, syntetyczne, polinukleotydy zaprojektowane zgodnie z zasadami komplementarności, które nadają specyficzność testom moleku-larnym przyłączając się tylko do regionów, o określonej sekwencji komplementarnej;

 Termostabilnego enzymu polimerazy, przeprowadzającego reakcję powielania materiału genetycznego w zmieniających się cyklach temperaturowych;

 Mieszaniny reakcyjnej, zapewniającej optymalne warunki oraz składniki do przeprowadzenia reakcji dla enzymu – polimerazy [11].

Etapy jednego cyklu reakcji PCR obejmują:

 Denaturacja – przeprowadzana w temperaturze ~95°C mająca na celu rozplecenie podwójnej helisy DNA pod wpływem pękania wiązań wodorowych.

 Przyłączanie się starterów – przeprowadzane w temperaturze która jest zależna od sekwencji wykorzystywanych starterów, na tym etapie polinukleotydy przyłączają się zgodnie z zasadą komplementarności do konkretnych odcinków materiału genetycznego.

 Elongacja – przeprowadzana w temperaturze ~72°C, w której zachodzi synteza odcinka DNA, oflankowanego przez startery, przez polimerazę [12].

5. Materiały i metody

W badaniach molekularnych na obecność Pseudomonas syringae wykorzystano odmianę reakcji PCR – Direct PCR która umożliwia przeprowadzenie amplifikacji kwasów nukleinowych, bezpośrednio na tkance porażonej rośliny, bez potrzeby izolacji materiału genetycznego.

Przygotowanie materiału do badań oraz reakcja Direct PCR zostały przepro-wadzone z wykorzystaniem komercyjnego zestawu „Thermo Scientific Phire Plant Plant Direct PCR Master Mix” firmy Thermo Scientific [13].

5.1. Startery

Sekwencje starterów Psy F, Psy R użytych w badaniach molekularnych na obecność Pseudomonas syringae, zostały zastosowane z dostępnej publikacji: [14].

Wykorzystanie technik biologii molekularnej w diagnostyce Pseudomonas syringae na malinie Tabela 2. Sekwencje starterów Psy F, Psy R użytych w testach molekularnych na obecność Pseudomonas syringae

Nazwa Sekwencja (5'- 3')

Psy F ATGATCGGAGCGGACAAG

Psy R GCTCTTGAGGCAAGCACT

Źródło: Opracowanie własne

Sekwencje starterów Pse16S_F, Pse23S_R użytych w reakcji Direct PCR na obecność Pseudomonas spp., w celu korelacji wyników, zostały zastosowane z dostępnej publikacji [15].

Tabela 3. Sekwencje starterów Pse16S_F, Pse23S_R użytych w testach molekularnych na obecność Pseudomonas spp

Nazwa Sekwencja (5'- 3')

Pse16S_F ACTGACACTGAGGTGCGAAAGCG

Pse23S_R ACCGTATGCGCTTCTTCACTTGACC

Źródło: Opracowanie własne

5.2. Przebieg temperaturowy

Przebieg temperaturowy został opracowany na podstawie zaleceń opisanych w instrukcji zestawu „Thermo Scientific Phire Plant Plant Direct PCR Master Mix”

firmy Thermo Scientific”. Temperatura annealingu dla obu par starterów, została określona z wykorzystaniem kalkulatora sugerowanego przez producenta zestawu

„Thermo Scientific Phire Plant Plant Direct PCR Master Mix” firmy Thermo Scientific”: Tm Calculator.

Tabela 4. Przebieg temperaturowy dla reakcji Direct PCR z wykorzystaniem starterów Psy F, Psy R

Etap cyklu Temperatura Czas Ilość cykli

Denaturacja wstępna 98 °C 5 min x1

Denaturacja

Annealing

Elongacja

98 °C 62.2°C 72°C

5 s 5 s 20 s

x40

Elongacja końcowa 72°C 1 in x1

Źródło: Opracowanie własne

Karolina Felczak-Konarska, Michał Lechowski

Tabela 5. Przebieg temperaturowy dla reakcji Direct PCR z wykorzystaniem starterów Pse16S_F, Pse23S_R

Etap cyklu Temperatura Czas Ilość cykli

Denaturacja wstępna 98 °C 5 min x1

Reakcja Direct PCR została wykonana z wykorzystaniem komercyjnego zestawu

„Thermo Scientific Phire Plant Plant Direct PCR Master Mix” firmy Thermo Scientific [13].

Przed rozpoczęciem reakcji, wszystkie odczynniki zostały poddane mieszaniu przez worteksowanie. Skład mieszaniny reakcyjnej dla reakcji Direct PCR został opracowany na podstawie zaleceń opisanych w instrukcji zestawu „Thermo Scientific Phire Plant Plant Direct PCR Master Mix” firmy Thermo Scientific”.

W reakcji wykorzystano startery, o stężeniu wyjściowym 10 µM, specyficzne dla Pseudomonas syringae o sekwencji podanej w tabeli 2, dostępnej w rozdziale Materiały i Metody.

W celu korelacji wyników dokonano dodatkowej analizy z wykorzystaniem starterów specyficznych dla Pseudomonas spp., o stężeniu wyjściowym 10 µM, o sekwencji podanej w tabeli 3, dostępnej w rozdziale Materiały i Metody.

Reakcja Direct PCR przebiegała z wykorzystaniem termocyklera Simply Amp (Applied Biosystems). Przebieg temperaturowy dla reakcji Direct PCR z wykorzy-staniem starterów Psy F, Psy R podano w tabeli 4, dostępnej w rozdziale Materiały i Metody. Przebieg temperaturowy dla reakcji Direct PCR z wykorzystaniem starterów Pse16S_F, Pse23S_R podano w tabeli 5, dostępnej w rozdziale Materiały i Metody

6.3. Rozdział i wizualizacja wyników reakcji

Rozdział produktów reakcji PCR przeprowadzono w procesie rozdziału elektro-foretycznego w 1% żelu agarozowym w warunkach: 135 V przez 30 minut. Reakcja przebiegała z wykorzystaniem w urządzenia Mupid-One.

Wykorzystanie technik biologii molekularnej w diagnostyce Pseudomonas syringae na malinie

Zdjęcie żelu agarozowego po rozdziale elektroforetycznym wykonano za pomocą systemu do dokumentacji żeli omniDOC Gel Documentation System przy ekspozycji żelu na światło UV przez 15 sekund.

7. Wyniki

W wyniku reakcji Direct PCR z wykorzystaniem starterów specyficznych dla Pseudomonas syringae wykonanej na próbce maliny z pola na jednej z plantacji malin letnich otrzymano specyficzny produkt o wielkości 144 pz. widoczny na zdjęciu żelu agarozowego. W celu korelacji wyników dokonano dodatkowej reakcji Direct PCR z wykorzystaniem starterów specyficznych dla Pseudomonas spp wykonanej na tej samej próbce maliny z pola niedaleko Grójca, otrzymano produkt o wielkości 1300 pz.

widoczny na zdjęciu żelu agarozowego (fot. 5).

Fotografia 5. Zdjęcie żelu agarozowego, ukazującego specyficzne produkty powstałe w reakcji Direct PCR dla Pseudomonas syringae – 144 pz. oraz Pseudomonas spp. – 1300 pz. (M. Lechowski)

Karolina Felczak-Konarska, Michał Lechowski

8. Podsumowanie

Choroba powodowana przez patogeny bakteryjne niewątpliwie jest dużym zagro-żeniem na plantacjach uprawowych, szczególnie malin ze względu na brak obecnie zarejestrowanego produktu do zwalczania oraz poprawności identyfikacji czynnika biotycznego. Co więcej, patogeny do momentu ukazania się objawów chorobowych- możliwych do identyfikacji wizualnej, znajdują się w zaawansowanym stadium infekcji.

Powoduje to niemożliwość eliminacji negatywnego wpływu patogena zarówno na jakość, jak i ilość plonu. Dlatego w celu precyzyjnej i dokładnej identyfikacji wykorzy-stywane są metody molekularne, które dają znacznie większe możliwości diagnostyczne w porównaniu do metod tradycyjnych. W przypadku identyfikacji Pseudomonas syringae w badaniach wykorzystane zostały opracowane procedury amplifikacji DNA przy użyciu techniki DIRECT PCR. W wyniku przeprowadzonej weryfikacji moleku-larnej z wykorzystaniem techniki PCR, uzyskano szczegółową informację na temat identyfikacji patogena bakteryjnego na plantacji maliny. Prace z tym patogenem, a także z dalszą diagnostyką opartą na metodach molekularnych będą kontynuowane, ponieważ było to pierwsze doniesienie o obecności tego patogena na plantacjach towarowych.

Literatura

1. Felczak-Konarska K., Choroby pędów malin. Jak im zaradzić w nowym sezonie?, Truskawka, malina, jagoda, 4/2019, s. 50-53.

2. Łabanowska B., Cieślińska M., Doruchowski G., Meszka B., lisek J., Sekrecka M., Tartanus M., Treder W., Wójcik-Seliga J., Wójcik P., Michalecka M., Poniatowska A..

Metodyka Integrowanej produkcji Malin (materiały dla producentów), Instytut Ogrodnictwa, Skierniewice 2013, aktualizacja 2017, s. 14-22.

3. Sobiczewski P., Schollenberger M. Bakteryjne choroby roślin ogrodniczych, Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, ISBN 83-09-01761-8: 6-14, Warszawa 2002.

4. Olczak-Woltman H., Schollenberger M., Niemirowicz-Szczytt K., Charakterystyka i metody identyfikacji patogenicznych dla roślin bakterii na przykładzie Pseudomonas syringae pv. Lachrymans, Katedra Genetyki, Sggw, Rooelin, 2008.

5. Mansfield J., Genin S., Magori S., Citovsky V., Sriariyanum M., Ronald P., Dow M., Verdier V., Beer S.V., Machado M.A., Toth I., Salmond G., Foster Gary D., Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology, „Mol. Plant Pathol.” 6 (13) 2012, s. 614-629, DOI: 10.1111/j.1364-3703.2012.00804.x, PMID: 22672649 (ang.).

6. Milijašević-Marčić S., Rekanović, E. and Gavrilović V., Bacterial diseases of raspberry in serbia, Acta Hortic 946, 267-270, https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2012.946.43.

7. Koike S.T., Bolda M.P., Bull C.T., Pseudomonas blight caused by Pseudomonas syringae on raspberry in Calfornia., Plant Disease, 2014, 98:1151.

8. Žarko I.,, Slaviša S., Svetlana Ž., Veljko G., Milan K., Djordje F., Molecular

characterization of Pseudmonas syringae isolates from fruit trees and raspberry in Serbia, Europan Journal of Plant Pathology 134, 2012, s. 191-203.

9. Irzykowska L., Markery molekularne w diagnostyce chorób podstawy źdźbła i korzeni zbóż, Post. Nauk Rol., 2006, s. 31-40.

10. Johnson W.M., The polymerase chain reaction: An overview and development of diagnostic PCR protocols at the LCDC, Can J Infect. Dis. 1991, 2(2), s. 89-91, doi:10.1155/1991/580478.