Zakład Medycyny Sądowej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: dr hab. n. med. Mirosław Parafiniuk
Summary
The relationship between the bone digital histomor-phometry data of the femoral head and the age was in-vestigated. Proximal femur samples were obtained from 31 patients, during surgery for various orthopedic condi-tions. The histological section, through the fovea of the femoral head was taken. Tissue sections were decalcified and stained with haematoxilin and eosin. Those sections were used for further quantization. Histological image was scanned into the computer, using digital camera. With an image analysis computer program the following static measures were determined: number, area and circumfer-ence of trabeculas, bone marrow and empty spaces. Most parameters showed a weak association, when compared with age.
K e y w o r d s: histomorphometry – osteomorphometry – bone structure – digital microscopy.
Streszczenie
Ocena histomorfometryczna preparatów histologicz-nych kości jest narzędziem badawczym stosowanym do ilościowego opisu jakości tkanki kostnej oraz do opisu dynamiki procesów metabolicznych w niej zachodzących.
W ten sposób uzyskuje się liczbowy opis składowych tkanki kostnej. Wraz z upływem czasu dochodzi do na-turalnego i nieodwracalnego nagromadzenia się
uszko-dzeń wewnątrzkomórkowych, powyżej progu zdolności organizmu do samonaprawy. Prowadzi to do upośledzenia funkcjonowania komórek, tkanek, narządów i układów.
Wraz z wiekiem pojawiają się m.in. takie zmiany jak utrata masy mięśni i kości. celem niniejszej pracy jest próba wy-kazania istnienia ewentualnej korelacji pomiędzy danymi liczbowymi, pozyskanymi z obrazu histopatologicznego kości, z wiekiem. Materiał badawczy stanowiły barwione hematoksyliną i eozyną preparaty histopatologiczne głów kości udowych, pochodzące od 31 pacjentów, uzyskane po zabiegu alloplastyki stawu biodrowego. Obraz z mikro-skopu Nikon eclipse 6600 rejestrowano za pomocą kamery cyfrowej Sony Hyper Had i wprowadzono do komputera.
Do wykonania niezbędnych pomiarów geometrycznych zastosowano program komputerowy KS 300 Imaging Sys-tem Release 3.0. Uzyskane dane poddano dalszej analizie statystycznej. W pierwszym etapie obliczeń wykonano statystykę opisową zmierzonych wielkości. W następnych skorelowano otrzymane wyniki z wiekiem. Jedynie poje-dyncze ze zmierzonych parametrów okazały się w sposób istotny statystycznie skorelowane z wiekiem, tzn. poziom istotności testu był niższy niż 0,05. Tym samym, niemal dla wszystkich zmierzonych wartości wykazano brak korelacji z wiekiem. Biorąc pod uwagę wielkość grupy badanej, nie można wykluczyć, że zaobserwowana w pojedynczych przypadkach istotna statystycznie korelacja z wiekiem jest jedynie przypadkowa.
H a s ł a: histomorfometria – osteomorfometria – struktura kości – mikroskopia cyfrowa.
HISTOPATOLOGIcZNY OPIS GŁÓW KOŚcI UDOWYcH 123
Wstęp
Cyfrowa analiza obrazu (digital image analysis – DIA) jest narzędziem opisującym w sposób ilościowy obrazy cy-frowe. Rozwój DIA rozpoczął się w latach 50. ubiegłego stulecia, a od początku lat 70. była już w pełni samodzielnym narzędziem badawczym. Ostatecznie gwałtowny rozwój DIA był warunkowany postępem informatycznym. Nadal jednak to narząd wzroku jest najdoskonalszym narzędziem analizy obrazu, szczególnie w zakresie wydzielenia z widzianego obrazu wysokospecjalistycznych, wieloskładnikowych czy nietypowych informacji. W wielu przypadkach czynnik ludz-ki jest nie do zastąpienia przez komputery. Nie należy równo-cześnie zapominać, że tak skomplikowane układy analityczne jak detektory krawędzi czy sieci neuronowe były inspirowane przez model ludzkiej percepcji obrazu. Dlatego też cyfrową analizę obrazu należy postrzegać nie jako narzędzie zastępu-jące, ale wspomagające człowieka. Również w patologii coraz szerzej stosowane są metody cyfrowe, takie jak fotografia cyfrowa, poszczególne aplikacje obrazowania cyfrowego czy mikroskopia komputerowa. Ocena histomorfometryczna preparatów histologicznych kości (osteomorfometria) jest narzędziem badawczym stosowanym do ilościowego opisu jakości tkanki kostnej oraz do opisu dynamiki procesów metabolicznych w niej zachodzących. W ten sposób uzyskuje się liczbowy opis składowych tkanki kostnej [1, 2]. Zmiany ilościowe w zakresie obrazu tkanki kostnej można zaobser-wować w takich procesach patologicznych jak: osteodystrofia nerkowa, osteoporoza, schorzenia przytarczyc.
celem niniejszej pracy była próba wykazania istnie-nia ewentualnej korelacji pomiędzy pozyskanymi z obrazu histopatologicznego kości danymi liczbowymi a wiekiem osobniczym.
Materiał i metody
Przedmiot badania stanowiły preparaty histopato-logiczne głów kości udowych, barwione hematoksyliną
i eozyną, pochodzące od 31 pacjentów, uzyskane po za-biegu alloplastyki stawu biodrowego. W pierwszym etapie pomiaru prowadzono rejestrację obrazu mikroskopowe-go (mikroskop Nikon eclipse 6600) za pomocą kamery cyfrowej (Sony Hyper Had). Tak zarejestrowane obrazy wprowadzono do komputera. Do wykonania niezbędnych pomiarów geometrycznych zastosowano program kom-puterowy KS 300 Imaging System Release 3.0. Kolejne etapy badania obejmowały: wybór miejsca pomiarowego i wprowadzenie obrazu mikroskopowego do komputera;
identyfikację konkretnych obiektów pomiarowych, np. be-leczek kostnych; pomiar z uzyskaniem danych surowych.
Otrzymano w ten sposób wartości geometryczne w postaci:
powierzchni, powierzchni opisanych, powierzchni nionych oraz obwodów, obwodów opisanych oraz wypeł-nionych dla: beleczek kostnych, zwizualizowanych tkanek z wyłączeniem beleczek kostnych oraz pustych obszarów w polu widzenia. Uzyskane dane liczbowe poddano dalszej analizie statystycznej. W pierwszej kolejności zastosowa-no korelacje liniowe. Następnie z uwagi na fakt, że część ze zmiennych miała rozkład odbiegający od normalnego, w celu uprecyzyjnienia obrazu zależności zastosowano ob-liczenie współczynników korelacji nieparametrycznych.
Dla wartości skokowych (liczba beleczek) zastosowano test tau-Kendalla, dla ciągłych (powierzchnie i obwody) test R Spearmana.
Wyniki
Z uwagi na olbrzymią liczbę danych zarówno surowych, jak i porównawczych, w niniejszej pracy przedstawiono jedynie przykładowe tabele wyników (tab. 1 i 2).
W wyniku przeprowadzonych obliczeń współczynni-ków korelacji liniowej stwierdzono, że jedynie pojedyncze parametry okazały się skorelowane z wiekiem, tzn. po-ziom istotności testu był niższy niż 0,05. Również po ob-liczeniu współczynników korelacji nieparametrycznych stwierdzono, że jedynie pojedyncze parametry okazały
T a b e l a 1. Przykład korelacji liniowej (parametrycznej) zmiennych geometrycznych, przedstawiony dla liczby beleczek w polu widzenia – z wiekiem
T a b l e 1. Illustration of linear (parametric) correlation of geometric variables, presented for the number of trabecules in microscopic view – with age
X Y n R R2 (%) p Y = a + bX
a b
Wiek / Age
LI_B_1 23 0,411247 16,9124 0,051232 -1,8 0,07
LI_B_2 23 0,103220 1,0654 0,639303 2,4 0,02
LI_B_3 23 0,372632 13,8854 0,079925 -0,3 0,06
LI_I_1 23 -0,059521 0,3543 0,787333 340,6 -1,12
LI_I_2 23 -0,074986 0,5623 0,733824 397,0 -1,46
LI_I_3 23 -0,320983 10,3030 0,135338 661,0 -5,43
LI_P_1 23 -0,036671 0,1345 0,868065 76,5 -0,24
LI_P_2 23 0,102025 1,0409 0,643207 17,5 1,04
LI_P_3 23 -0,285545 8,1536 0,186583 204,9 -1,99
X – zmienna niezależna / independent variable; Y – zmienna zależna / dependent variable; n – wielkość próby / sample value; R – współczynnik korelacji liniowej / linear correlation coefficient; Y = a + bX – równanie prostych regresji dla populacji próby (gdzie a i b są współczynnikami równania regresji) / simple regression equation For trial population (in which a and b are the coefficients of regression equation)
124 OKTAWIAN KNAP, PIOTR WALOSZCZYK
się skorelowane z wiekiem, tzn. poziom istotności testu był niższy niż 0,05. Reasumując, niemal dla wszystkich zmierzonych wartości wykazano brak istotnej statystycznie korelacji z wiekiem.
Dyskusja
Dane dotyczące zastosowania cyfrowej analizy obrazu dla potrzeb opisu jakościowego tkanki kostnej w przeanali-zowanej literaturze są stosunkowo skąpe. Większość autorów wskazuje na fakt, że zastosowanie metod półilościowych, półautomatycznych czy wręcz manualnych w zasadzie wy-klucza międzyośrodkowe porównania wyników tak prze-prowadzonych badań. Zastosowanie w niniejszym badaniu metody cyfrowej do oceny morfometrycznej preparatów histopatologicznych głów kości udowych pozwoliło na po-zyskanie zbioru danych liczbowych, który z powodzeniem można było następnie poddać szerokiej analizie statystycznej.
W analizowanej literaturze istnieją jedynie pojedyncze i ogól-ne wnioski dotyczące zjawisk poddających się pomiarowi w zakresie preparatu histopatologicznego kości. Ustalono na przykład, że objętość maleje z wiekiem; front minera-lizacji powinien stanowić ok. 80% powierzchni osteoidu, a wartość ta również spada z wiekiem (wartość poniżej 20%
wskazuje na definitywne zaburzenia mineralizacji). część autorów twierdzi, że u kobiet wraz z wiekiem maleje objętość kości gąbczastej, natomiast u mężczyzn tendencja owa jest wyraźnie mniej znaczona [3]. Analogiczną zależność w za-kresie wieku stwierdzili i inni badacze, choć jednocześnie obserwuje się również proces spadku grubości pakietów be-leczek kostnych oraz odległości pomiędzy beleczkami, jak i wzrost powierzchni erozji – wraz z wiekiem [4]. Za pomocą pomiaru osteonów (średnica, grubość ściany i kanału) oraz pomiarów wskaźników dynamicznych, po podaniu
tetracy-kliny, u 56 zdrowych osób stwierdzono, że uzyskane wartości są niezależne od wieku, choć odsetek osteonów wykazujących aktywność metaboliczną był niższy u osób starszych. Jedno-cześnie większość parametrów metabolicznych była większa w wewnętrznej części kości zbitej niż w zewnętrznej [5].
Poprzez pomiary biopsji talerza biodrowego wykonane u 43 zdrowych mężczyzn, a także dodatkowo poprzez różnego rodzaju badania laboratoryjne próbek osocza krwi oraz moczu wykazano, że pojedyncze parametry histomorfometryczne (objętość kości gąbczastej oraz powierzchnia pomiędzy oste-oblastami i osteoidem – jest to parametr specyficzny dla tego badania i nie spotykany w innych) obniżyły się znacząco w przedziale wieku 20–80 r.ż. Biorąc pod uwagę wielkość grupy badanej, nie można wykluczyć, że w pojedynczych przypadkach korelacja z wiekiem jest przypadkowa. Cyfrowa analiza obrazu jest metodą obiektywizującą i wspomagającą histopatologiczną ocenę jakościową. Znajduje ona swoje za-stosowanie w osteometrii poprzez skrócenie czasu wykonania badania oraz zmniejszenie możliwości wystąpienia błędu ludzkiego, jakkolwiek z całą pewnością wymaga dalszych, szerzej zakrojonych badań.
Piśmiennictwo
Parfitt A.M., Drezner M.K., Glorieux F.H., Kanis J.A., Malluche H., 1. Meunier P.J. et al.: Bone histomorphometry: standardization of
no-menclature, symbols, units. J. Bone Miner. Res. 1987, 6, 595–561.
Becht R., Knap O., Parafiniuk O., Zdziarska B.M.
2. :
Immunohistoche-mical findings and digital image analysis of bone marrow angiogenesis in multiple myeloma patients before and after first line chemioterapy.
Haematologica, 2005, 90, suppl. 2, 429–430. errata: Haematologica, 2005, 90, 10, 1438.
Revell P.A.
3. : Histomorphometry of bone. J. clin. Pathol. 1983, 36, 1323–1331.
Chavassieux P. Meunier P.J.
4. : Histomorphometric approach of bone
loss in men. calciff Tissue Int. 2001, 69, 209–213.
Rauch F., Travers R., Glorieux F.H.
5. : Intracortical remodeling during
human bone development – a histomorphometric study. Bone, 2007, 40 (2), 274–280.
Komentarz
Autorzy przedstawili próbę obiektywizacji oceny hi-stopatologicznej głów kości udowych, korelując oceniane parametry z wiekiem. Zastosowanie w badaniu techniki morfometrii i cyfrowej analizy obrazu jest pewnym no-vum w medycynie sądowej. Niewątpliwie wymaga zebrania szerszych doświadczeń i znacznie obszerniejszych danych, także międzyośrodkowych, które pozwoliłyby na praktyczną obiektywizację omawianych badań.
dr hab. n. med. Mirosław Parafiniuk
T a b e l a 2. Przykład korelacji nieparametrycznej zmiennych geometrycznych, przedstawiony dla liczby beleczek w kolejnych
polach widzenia – z wiekiem
T a b l e 2. Illustration of nonparametric correlation of geometric parameters expressed for bar numbers in consequent microscopic
views – with age Para zmiennych
Pair of variables n tau-Kendalla tau-Kendall p
A N N A L E S A C A D E M I A E M E D I C A E S T E T I N E N S I S
R O C Z N I K I P O M O R S K I E J A K A D E M I I M E D Y C Z N E J W S Z C Z E C I N I E 2007, 53, SUPPL. 2, 125–128
SŁAWOMIR MAJDANIK, WIESŁAWA OROWICZ1, KRZYSZTOF BOROWIAK, BARBARA POTOCKA-BANAŚ