Agnieszka Zbela1
Streszczenie: Białko wiążące kasetę TATA (ang. TATA-binding protein, TBP) stanowi rdzeń kompleksu białkowego TFIID, który odgrywa podstawową rolę w inicjacji transkrypcji genów u Eukaryota. Wiedza na temat TBP z jedwabnika morwowego Bombyx mori (bmTBP) pozostaje szczątkowa. Przedstawione w pracy wstępne analizy bioinformatyczne oraz nadekspresja bmTBP w układzie bakteryjnym stanowią pierwszy krok do głębszego zrozumienia funkcji białka na poziomie molekularnym.
Słowa kluczowe: białko wiążące kasetę TATA, TBP, jedwabnik morwowy, Bombyx mori
1. Wprowadzenie
W organizmach eukariotycznych występują trzy rodzaje polimeraz RNA, które biorą udział w procesie transkrypcji genów. Skuteczna inicjacja transkrypcji wymaga oddziaływania różnych zestawów czynników transkrypcyjnych z promotorem ekspresjonowanego genu. Spośród wielu czynników transkrypcyjnych wspólnym dla trzech polimeraz RNA jest białko wiążące kasetę TATA (TBP, ang. TATA-binding protein) [1]. TBP stanowi rdzeń kompleksu białkowego TFIID i oddziałuje bezpośrednio z konsensusową sekwencją TATA w obrębie promotora podstawowego dla polimerazy RNA II [2]. Białko jest również zaangażowane w transkrypcję genów przez polimerazę RNA I jako podjednostka kompleksu SL1 oraz wchodzi w skład kompleksu TFIIIB, który oddziałuje z promotorem dla polimerazy RNA III [3,4]. Porównanie sekwencji aminokwasowych TBP z różnych organizmów (wyniku nie pokazano) wykazuje, że białko posiada zachowaną w toku ewolucji domenę końca C, a sekwencja regionu końca N TBP jest zróżnicowana i mniej konserwatywna.
Z uwagi na kluczową rolę TBP w inicjacji transkrypcji oraz brak doniesień literaturowych na temat molekularnych funkcji białka wiążącego kasetę TATA z jedwabnika morwowego Bombyx mori (bmTBP), obiekt ten wydaje się niezwykle interesujący. Sekwencję kodującą bmTBP uzyskano z biblioteki cDNA jedwabnika morwowego [5]. Podobnie jak u innych Eukaryota, bmTBP kodowane jest przez pojedynczą kopię genu. Ponadto białko to posiada konserwatywną domenę C-końcową oraz mniej zachowany region końca N, który zawiera sekwencję poliglutaminową [5]. Wiedza dotycząca struktury pełnej długości bmTBP, znaczenia końca N w aktywności bmTBP oraz dotycząca partnerów białkowych, mogących modulować funkcję białka, pozostaje szczątkowa. Wstępne analizy bioinformatyczne, nadekspresja w układzie bakteryjnym oraz optymalizacja warunków oczyszczania bmTBP stanowią pierwszy krok do głębszego zrozumienia funkcji bmTBP na poziomie molekularnym.
1 Wydziałowy Zakład Biochemii, Politechnika Wrocławska, Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław agnieszka.zbela@pwr.wroc.pl
183
2. Materiały i metody
2.1. Konstrukt pQE-80L_bmTBP
Plazmid zawierający sekwencję cDNA, która koduje pełnej długości TBP z Bombyx mori (pQE-80L_bmTBP), został skonstruowany przez dr. inż. Marka Orłowskiego (Wydziałowy Zakład Biochemii, Politechnika Wrocławska) w oparciu o wektor pET19b_TBP otrzymany od K.U.
Sprague [5].
2.2. Nadekspresja bmTBP w komórkach Eschrichia coli
Komórki kompetentne E. coli szczepu BL21(DE3)pLysS transformowano wektorem pQE-80L_bmTBP. Hodowlę bakteryjną prowadzono w płynnej pożywce LB lub TB. W pierwszym kroku do sterylnych kolb zawierających po 15 ml pożywki LB bądź TB wraz z karbenicyliną i chloramfenikolem, przenoszono zawiesinę glicerolową transformowanych komórek. Hodowlę wstępną inkubowano przez noc w 29ºC i przy 182 rpm. Wykorzystano ją do zaszczepienia 50 ml pożywki LB lub TB z karbenicyliną i chloramfenikolem. Hodowlę właściwą prowadzono w 29ºC i przy 182 rpm do uzyskania gęstości optycznej OD600 równej 0,4-0,6 dla pożywki LB oraz OD600
0,8-0,9 dla TB. Pobierano 1 ml hodowli przed indukcją ekspresji białka (T0), a następnie hodowlę indukowano izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Po 0,5h; 1h; 2h; 3h od dodania IPTG pobierano po 2 ml płynu hodowlanego. 1 ml wykorzystano do zbadania nadekspresji bmTBP w komórkach bakteryjnych. W tym celu próbki wirowano, supernatant odrzucano, a osad komórek zawieszano w 75 µl buforu do nakładania próbek 2×SB [6]. Próbki, sprawdzające rozpuszczalność białka, wirowano, supernatant odrzucano, a masę komórkową zawieszano w 75 µl buforu do lizy z 1 mM DTT. Tak przygotowane próbki zamrażano i następnie rozmrażano, aby doprowadzić do lizy komórek. W kolejnym etapie hydrolizowano kwasy nukleinowe przy użyciu DNazy i RNazy.
Dzięki wirowaniu próbek po lizie oddzielono frakcje białek rozpuszczalnych (supernatant) od nierozpuszczalnych (osad). Osady zawieszano w 75 µl 2×SB, a do supernatantów dodano po 50 µl 2×SB. Próbki zamrożono i poddano analizie elektroforetycznej oraz Western blot [6].
2.3. SDS-PAGE i Western blot
Analizę ekspresji i rozpuszczalności bmTBP wykonano za pomocą SDS-PAGE i Western blot. Elektroforezę prowadzono w układzie nieciągłym. Stosowano 4% żel zagęszczający i 12% żel rozdzielający. Wykorzystywano mieszaninę białek standardowych, The Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific), jako znacznik wagowy. Białka w żelu wizualizowano stosując barwnik Coomassie Brilliant Blue R-250 [7].
Analizę z wykorzystaniem techniki Western blot prowadzono poprzez wykonanie transferu białek z żelu poliakrylamidowego na błonę nitrocelulozową przy stałym napięciu. Następnie blokowano miejsca wiążące na błonie nitrocelulozowej za pomocą odtłuszczonego mleka. Do detekcji bmTBP stosowano kolejno: przeciwciała pierwszo- i drugorzędowe oraz roztwory A i B (ECLTM Plus Western Blotting Detection Reagent, Amersham Biosciences). Obrazy błon po detekcji dokumentowano aparatem FLA-3000 (Fujifilm).
2.4. Analizy bioinformatyczne
Do przewidywania struktury drugorzędowej oraz przynależności bmTBP do danej grupy białek korzystano z programów: PONDR® (Predictor Of Naturally Disordered Regions: VL-XT, Charge-hydropathy analysis) [8], FoldIndex© [9]. Przewidywania struktury trzeciorzędowej wykonano korzystając z serwera I-TASSER – Protein Structure and Function Prediction [10].
184
3. Wyniki i dyskusja
3.1. Analizy bioinformatyczne bmTBP
W celu wykonania wstępnej analizy struktury drugo- i trzeciorzędowej bmTBP wykorzystano szereg narzędzi bioinformatycznych. Programy FoldIndex© i PONDR® VL-XT pozwalają przewidzieć, na podstawie sekwencji aminokwasowej białka, które fragmenty mogą posiadać zdefiniowaną strukturę drugorzędową, a które są inherentnie nieuporządkowane [8,9].
W przypadku bmTBP obydwa programy przewidują, że koniec C tego białka posiada globularną strukturę (Rys.1.A,C). Wynik, uzyskany w szczególności programem PONDR® VL-XT, pokazuje, że region końca N bmTBP może wykazywać cechy typowe dla regionów inherentnie nieuporządkowanych (Rys.1.C), jak np. brak unikalnej struktury drugo– i trzeciorzędowej w warunkach fizjologicznych [11]. Na podstawie zależności ładunku i hydrofobowości białka wykres Uversky’ego pozwolił zaklasyfikować bmTBP do grupy białek o strukturze globularnej (Rys.1.B).
Rys. 1. Przewidywanie obecności fragmentów o zdefiniowanej strukturze drugorzędowej oraz regionów inherentnie nieuporządkowanych w bmTBP.
(A) Analiza sekwencji aminokwasowej wykonana przy użyciu programu FoldIndex© [9].
(B) Wykres Uversky’ego: przynależność bmTBP do białek globularnych [8].
(C) Analiza sekwencji aminokwasowej wykonana przy użyciu algorytmu PONDR® VL-XT [8].
185
Dzięki serwerowi I-TASSER możliwe było stworzenie modelu struktury trzeciorzędowej bmTBP na podstawie sekwencji aminokwasowej [10]. Dodatkowo wygenerowano struktury trzeciorzędowe TBP z Drosophila melanogaster (dmTBP) oraz Aedes aegypti (aaTBP). Nałożenie wszystkich trzech modeli wykazało, że domeny końca C posiadają zdefiniowane struktury i zgodnie z doniesieniami literaturowymi są zachowane w toku ewolucji (Rys.2.A,C). Z kolei regiony N tych trzech białek są bardzo zróżnicowane i mogą posiadać szczątkowe struktury drugorzędowe (Rys.2.A,B).
Rys. 2. Nałożenie modeli struktur trzeciorzędowych białek: bmTBP (Bombyx mori), dmTBP (Drosophila melanogaster) oraz aaTBP (Aedes aegypti). Przewidywania wykonano za pomocą programu I-TASSER [10]. Kolorem
jasnoczerwonym i czerwonym zaznaczono bmTBP; jasnoniebieskim i niebieskim - dmTBP;
jasnożółtym i żółtym – aaTBP.
(A) Modele struktur trzeciorzędowych białek pełnej długości.
(B) Modele regionów końca N TBP (NTD, ang. N-terminal domain).
(C) Modele domeny końca C TBP (CTD, ang. C-terminal domain).
3.2. Analiza nadekspresji bmTBP w płynnej pożywce LB i TB
Podstawowym celem niniejszych eksperymentów była optymalizacja warunków nadekspresji bmTBP w układzie bakteryjnym, zaproponowanych wstępnie przez A. Pietrzyk [12].
Dobranie odpowiednich warunków syntezy bmTBP jest konieczne po to, aby można było opracować wydajną procedurę oczyszczania białka, które następnie posłuży do przeprowadzenia właściwych badań biochemiczno-strukturalnych. W celu poprawienia wydajności syntezy bmTBP w E. coli sprawdzono wpływ dwóch pożywek hodowlanych (LB i TB) na poziom ekspresji białka.
Analizy elektroforetyczne i Western blot nadekspresji bmTBP w pożywce LB i TB wykazały, że białko jest obecne zarówno we frakcjach rozpuszczalnych, jak i nierozpuszczalnych
186
(Rys.3). Na żelach poliakrylamidowych wybarwionych Coomassie Brilliant Blue R-250 trudno jest dostrzec pasmo odpowiadające bmTBP. Dopiero analiza Western blot pozwala potwierdzić obecność białka. Nie widać znaczącej różnicy w wydajności ekspresji bmTBP w obu pożywkach hodowlanych. Analiza Western blot pokazała, że po 2h od dodania IPTG do hodowli w LB lub TB, bmTBP ulega znacznej degradacji, co widoczne jest dla śladów T2h i T3h (Rys.3.B,D).
Rys. 3. Wyniki analiz elektroforetycznych i Western blot nadekspresji bmTBP w pożywce LB i TB.
(A) Analiza elektroforetyczna nadekspresji w medium LB.
(B) Analiza Western blot nadekspresji w medium LB.
(C) Analiza elektroforetyczna nadekspresji w medium TB.
(D) Analiza Western blot nadekspresji w medium TB.
PMWM - Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific); T – wszystkie białka lizatu komórkowego; P – frakcje białek nierozpuszczalnych; S – frakcje białek rozpuszczalnych; 0 – próbka przed indukcją; 30’, 1h, 2h, 3h – próbki
pobierane w danych odstępach czasowych po indukcji. Strzałką zaznaczono pasmo odpowiadające bmTBP w żelu poliakrylamidowym (A, C) i na błonie nitrocelulozowej (B, D). Teoretyczna masa bmTBP, obliczona przy użyciu
programu ProtParam Tool (http://web.expasy.org/protparam/), wynosi 35,4 kDa.
4. Podsumowanie
Przeprowadzone analizy bioinformatyczne pozwoliły na zaklasyfikowanie bmTBP do grupy białek globularnych, czyli posiadających zdefiniowaną strukturę drugo- i trzeciorzędową.
Przewidywania sugerują również, że region końca N może wykazywać właściwości regionów inherentnie nieuporządkowanych i jednocześnie posiadać szczątkowe struktury drugorzędowe.
Analiza nadekspresji bmTBP w różnych mediach hodowlanych wykazała, że białko jest obecne we frakcjach rozpuszczalnych, co wraz z obecnością w białku znacznika sześciohistydylowego pozwoli na optymalizację warunków oczyszczania. Wydajność ekspresji bmTBP w pożywce TB i LB nie różni się znacząco. Należy to dodatkowo zweryfikować prowadząc oczyszczanie białka z obu mediów hodowlanych. bmTBP może posiadać również tendencję do degradacji. Dalsza optymalizacja warunków ekspresji białka, a następnie jego izolacji, pozwoli na otrzymanie homogennego preparatu i zbadanie właściwości molekularnych bmTBP.
187
Literatura
[1] K. Struhl (1994). Duality of TBP, the universal transcription factor. Science 263: 1103–1104.
[2] G. Orphanides, T. Lagrange, D. Reinberg (1996). The general transcription factors of RNA polymerase II. Genes Dev. 10: 2657–2683.
[3] L. Comai, N. Tanese, R. Tjian (1992). The TATA-binding protein and asssociated factors are integral components of the RNA polymerase I transcription factor SL1. Cell 68: 965–976.
[4] G.A. Kassavetis, C.A.P. Joazeiro, M. Pisano, E.P. Geiduschek, T. Col-bert, S. Hahn, J.A.
Blanco (1992). The role of the TATA-binding protein in the assembly and function of the multisubunit yeast RNA polymerase III transcription factor, TFIIIB. Cell 71: 1055–1064.
[5] C. Ouyang, K.U. Sprague (1998). Cloning and characterization of the TATA-binding protein of the silkworm Bombyx mori. Gene 221: 207–213.
[6] J. Sambrook, E.E. Fritsch, T. Maniatis (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[7] U.K. Laemmli (1970). Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
[8] P. Romero, Z. Obradovic, A.K. Dunker (1997). Sequence data analysis for long disordered regions prediction in the calcineurin family. Genome Inform Ser Workshop Genome Inform 8:
110–124.
[9] J. Prilusky, C.E. Felder, T. Zeev-Ben-Mordehai, E.H. Rydberg, O. Man, J.S. Beckmann, I. Silman, J.L. Sussman (2005). FoldIndex©: a simple tool to predict whether a given protein sequence is intrinsically unfolded. Bioinformatics Applications Note 21: 3435–3438.
[10] Y. Zhang (2008). I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics 9, 40.
[11] V.N. Uversky (2011). Intrinsically disordered proteins from A to Z. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 43: 1090–1103.
[12] A. Pietrzyk (2009). Otrzymanie rekombinowanych regionów końca N białek EcR i Usp z Bombyx mori. Praca magisterska. Zakład Biochemii Politechniki Wrocławskiej.
Podziękowanie: Dziękuję Dr. inż. Markowi Orłowskiemu z Wydziałowego Zakładu Biochemii Politechniki Wrocławskiej za użyczenie konstruktu pQE-80L_bmTBP do analiz.
Praca była finansowana z dotacji Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego na działalność statutową Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej.
TATA
-
BINDING PROTEIN FROM BOMBYX MORI:
BIOINFORMATIC ANALYSES AND OVERPRODUCTION IN BACTERIAL CELLS
The TATA-binding protein (TBP) is the central core protein of the multiprotein complexes required by all three eukaryotic RNA polymerases. These distinctive complexes play a significant role in transcription of genes in eukaryotes. TBP as the component of the transcription factor II D (TFIID) binds directly to the consensus sequence - TATA box. TBPs share a common structural organization with functional regions: a highly variable in a sequence and length N-terminal region and an evolutionally conserved TATA-box binding C-terminal domain. The structural information about N-terminal region of bmTBP, its potential binding partners and a role of the full-length protein in regulation of transcription initiation are not known. These facts make bmTBP worth examining. Preliminary bioinformatic analyses, an overexpression of bmTBP and then its purification allow us to conduct biochemical research of bmTBP molecular properties.
188