Identyfikacja lipopolisacharydów patogennych szczepów Escherichia coli

Justyna Bazan¹

Streszczenie: Lipopolisacharyd jest heteropolimerem, a w jego budowie wyróżnia się trzy podstawowe elementy: lipid A, rdzeń (wewnętrzny i zewnętrzny) oraz O-antygen. Na podstawie charakterystycznej budowy O-antygenu wyróżniany jest serotyp szczepu bakteryjnego. W pracy przedstawiono porównanie lipopolisacharydów wybranych szczepów Escherichia coli.

Słowa kluczowe: bakteriofagi, E.coli, lipopolisacharyd, O-antygen, oczyszczanie

1. Wprowadzenie

Lipopolisacharyd (LPS, endotoksyna bakteryjna) to główny składnik błony zewnętrznej prawie wszystkich bakterii Gram−ujemnych. LPS jest czynnikiem odpowiedzialnym za patogenność bakterii, stanowi także ochronę przed elementami układu odpornościowego i utrudnia wnikanie związków hydrofobowych do komórki [1, 2].

Lipopolisacharyd jest heteropolimerem. W jego budowie można wyróżnić trzy podstawowe elementy: lipid A, rdzeń (wewnętrzny i zewnętrzny) oraz O-antygen. Różne formy bakterii charakteryzują się inną długością łańcucha O-swoistego. Najkrótszy łańcuch posiadają formy szorstkie, najdłuższy – gładkie, istnieją także formy głęboko szorstkie posiadające LPS o skróconym rdzeniu. Polisacharydowy łańcuch O-swoisty charakteryzuje duża zmienność budowy, w przeciwieństwie do hydrofobowego lipidu A oraz rejonu Kdo (kwas 2-keto-3-deoksyoktulozonowy) rdzenia, które są elementami o bardzo konserwatywnej strukturze [3, 4].

Duże zróżnicowanie łańcuchów O-swoistych (antygen powierzchniowy) jest przyczyną występowania wielu różnych serologicznie szczepów, nawet w obrębie tego samego gatunku.

O-antygen jest homo- lub heteropolimerem składającym się z powtarzających się oligosacharydowych podjednostek, z których każda zawiera do ośmiu reszt monocukrowych.

Podjednostki te wykazują zróżnicowanie pod względem składu chemicznego, kolejności ułożenia cukrów, typu wiązań, rodzaju odgałęzień bocznych oraz zawartości niecukrowych podstawników takich jak: aminokwasy, fosforany, rybitol, glicerol czy kwas sialowy. Cukry obecne w łańcuchu O-swoistym nadają mu charakter obojętny, kwaśny lub zasadowy [5].

Uwalnianie LPS ze ściany komórki bakteryjnej następuje na skutek namnażania bakterii lub lizy ich komórek np. w wyniku infekcji wirusem bakteryjnym. Cząsteczka lipopolisacharydu, gdy pozostaje związana ze ścianą komórki bakteryjnej, nie jest toksyczna, ale po odłączeniu, jej toksyczna część – lipid A przyczynia się do rozwoju odpowiedzi zapalnej. Niekontrolowane uwalnianie LPS do układu stanowi jedno z zagrożeń terapii fagowej [6, 7].

1 Zakład Chorób Układu Nerwowego Wydział Nauk o Zdrowiu Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Bartla 51-618 Wrocław, e-mail: justyna.bazan@umed.wroc.pl

65

2. Materiały i Metody

- Wykorzystywane podłoża. Wykorzystano następujące podłoża: bulion cukrowy, podłoże McConkey’a, podłoże krwawe oraz agarowe.

- Szczepy bakteryjne i hodowla. Szczepy bakteryjne Escherichia coli otrzymano przez izolację z materiału biologicznego pobranego od zakażonych zwierząt hodowlanych.

Bakterie przechowywano w 20% glicerolu buforowanym PBS w -70°C i aktywowano przez noc w 37°C na podłożu MacConkey’a. Następnie bakterie zawieszano w bulionie suplementowanym 10% glukozą.

- Izolacja lipopolisacharydu metodą wodno-fenolową [8]. Hodowlę bakteryjną przeprowadzono według procedury opisanej w literaturze po czym płynną hodowlę przeniesiono do sterylnych probówek i wirowano przy 5000 obr./min. przez 15 minut.

Następnie supernatant zlano,

a osad bakteryjny zamrożono i liofilizowano. Suchą masę bakteryjną zawieszono w ciepłej wodzie miliQ (25 ml wody na 2 g suchej masy), następnie dodano taką samą objętość ciepłego fenolu. Mieszaninę ogrzewano w łaźni wodnej w temperaturze 65°C, po osiągnięciu żądanej temperatury inkubowano jeszcze przez 15 minut ciągle mieszając. Po tym czasie kolbkę z preparatem schłodzono do temperatury 5°C i wirowano w probówkach szklanych przy 2000 obr./min. przez 15 minut. Warstwę wodną zebrano i powtórzono ekstrakcję. Następnie dializowano warstwę wodną oraz warstwę fenolową do bieżącej wody przez 2 doby oraz przeprowadzono dializę do wody destylowanej przez noc. Po tym czasie obie warstwy przeniesiono do probówek wirówkowych i wirowano 20 min przy 3000×g. Supernatant zebrano i zagęszczano przez ultrafiltrację przez noc. Następnie przeprowadzono ultrawirowanie przy 37000 obr./min. przez 6 godzin. Czystość otrzymanego LPS analizowano na spektrofotometrze (zakres długości fali od 190 nm do 400 nm).

- Oczyszczanie LPS. Otrzymaną frakcję zawierająca LPS oczyszczano przez ultrawirowanie (100000g, 5h). Kwasy nukleinowe zostały usunięte przez dodanie nukleazy (2µg/ml) i inkubację przez 4 godziny. Następnie preparat został poddany ponownemu ultrawirowaniu, a osad został zebrany. Czystość LPs okreslano spektrofotometrycznie przez analizę widma w zakresie 190-400 nm. Oczyszczony LPS został zliofilizowany.

- Metody analityczne. Do analizy preparatów wykorzystano standardowe metody laboratoryjne. Stężenie białka oznaczano metodą wg. Lowry’ego [9], a DNA zmodyfikowaną metodą wg. Dischego [10]. SDS-PAGE wykonano wg. Laemmli’ego [11].

LPS barwiono odczynnikiem srebrowym [12].

3. Wyniki i wnioski

W celu uzyskania czystych preparatów LPS pochodzących z pięciu patogennych bakterii E. coli izolowanych z preparatów pobranych od chorych zwierzą hodowlanych, przygotowano pięć hodowli bakteryjnych zgodnie z opisem, a następnie ekstrahowano tę endotoksynę metodą wodno-fenolową. Preparat po ekstrakcji oczyszczano trzykrotnie przez ultrawirowanie. Pozbyto się zanieczyszczeń absorbujących w zakresie 300-250 nm, a LPS E. coli analizowano elektroforetycznie w warunkach denaturujących SDS-PAGE i barwiono metodą z odczynnikiem srebrowym. Na przedstawionym elektroforogramie (Rys. 1) można zaobserwować duże pasmo szybko wędrującego LPS, w skład którego wchodzi lipid A i region Kdo. Widoczna jest również charakterystyczna drabinka cukrów pochodzących z O-antygenu. Widoczne są różnice w profilu cukrowym wszystkich analizowanych szczepów Echerichia coli. Uzyskane wyniki wskazują,

66

że wszystkie lipopolisacharydy, poza jednym przedstawionym jako profil nr 1, mają rozbudowany łańcuch O-antygenu.

Rys. 1. Analiza SDS-PAGE (w 12,5% żelu poliakrylamidowym) lipopolisacharydu patogennych szczepów E.

coli ekstrahowanych metodą wodno-fenolową. Żel był barwiony metodą srebrową z metanolem. Linie 1-5: LPS izolowany odpowiednio z 5 kolejnych szczepów bakteryjnych.

W wyniku przeprowadzonej analizy określono typ lipopolisacharydów patogennych szczepów bakterii E. coli, które są przyczyną nawracających zakażeń zwierząt hodowlanych.

Analiza ta jest pierwszym etapem w charakterystyce typu hemolizujących patogenów powodujących ostre infekcje drogi pokarmowej. Widoczna na elektroforogramie (Rys. 1) wyraźna, rozbudowana drabinka, świadczy o dużej ilości podjednostek oligosacharydowych w strukturze LPS. Wszystkie te dane jednoznacznie wskazują, że uzyskany z E. coli LPS jest lipopolisacharydem gładkim. Jedynie LPS szczepu nr 1 prawdopodobnie ma krótszy łańcuch O, jednej także należy zaliczać go do typu gładkiego. Kolejnym etapem badań jest określenie pełnego profilu cukrowego LPS oraz serotypu bakterii oraz zdefiniowanie genów toksyczności, co pozwoli na doprecyzowanie typu bakterii odpowiedzialnej za znaczną ilość zakażeń zwierząt na terenie Dolnego Śląska.

"Badania współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego"

Literatura

[1] J. Saluk-Juszczak, Znaczenie lipopolisacharydu bakteryjnego w procesie aktywacji płytek krwi, Postępy biologii komórki, 34, 159-172, 2007

[2] D. Tichaczek−Goska, A. Cisowska, Wybrane właściwości lipopolisacharydów bakterii Gram−ujemnych zawierających mannan w łańcuchu O−swoistym, Adv Clin Exp Med, 16, 105-112, 2007

[3] K.F. Jarrell, A.M. Kropinski, Pseudomonas aeruginosa Bacteriophage 4PLS27- Lipopolysaccharide Interactions, Journal Of Virology, 40(2), 411-420, 1981

[4] J. Lodowska, A. Zięba, D. Wolny, L. Węglarz, Z. Dzierżewicz, Metody derywatyzacji komponentów liposacharydów w ocenie ich struktury chemicznej technikami chromatograficznymi, Postępy Hig Med Dośw., 60, 113-128, 2006

67

[5] M. Mierzchała, M. Lipińska−Gediga, G. Durek, The Role of LBP in Transduction of Signal Induced by LPS and in Modulation of Immune System Response, Adv Clin Exp Med, 15, 127-134, 2006

[6] E. Brzozowska, J. Bazan, A. Gamian, Funkcja białek bakteriofagowych, Postępy Hig. Med.

Dośw., 65,167-176, 2011

[7] E. S.Van Amersfoort, T.J. Van Berkel, J. Kuiper, Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock, Clin Microbiol Rev, 16, 379-414, 2003

[8] O. Westphal, K. Jann, Bacterial lipopolysaccharides: extraction with phenol-water and further applications of the procedure, w R. Whistler (red.), Methods in carbohydrate chemistry, 5, 83-91. Academic Press, Inc., New York, N.Y. 1965

[9] O.H. Lowry, i wsp. Protein measurement with the Follin phenol reagent, J Biol Chem, 193, 265-275, 1951

[10] L. Messineo, J. D'amico, A test for ribose determination without interference from deoxyribose, Int J Biochem, 3, 351-356, 1972

[11] U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, 1970

[12] C.R. Merril, i wsp. Trace polipeptydes in cellular extracts and human body fluids detected by two-dimensional electrophoresis and highly sensitive silver strain, Proc Natl Acad Sci USA, 76, 4335-4339, 1979

I

E

Lipopolysaccharide (LPS, endotoxin) is a very important structure of the Gram-negative bacteria cell wall. For almost all Gram-negative bacteria LPS has similar chemical structure.

Typically it consist of a three components: hydrophobic domain known as lipid A, a nonrepeating core oligosaccharide and a distal polysaccharide or O-antigen. Rough (R) types of LPS contain only Lipid A region and core oligosaccharide, whereas O-antigen is characteristic for smooth type of LPS. This monosaccharide domain is attached to the core and serve as the most outer part of LPS molecule. Huge diversity within O-antigen region result in over 160 different O-antigen structures produced by Escherichia coli strains. Appearance of many different serological types of bacteria is connected with huge diversity in carbohydrates composition occurring within LPS molecule. In Escherichia coli this structure is responsible for the pathological consequences of bacterial infection including septic shock and other life threatening symptoms. The aim of this study was to determinate the type of LPS of pathogenic E. coli stains isolated from sick animals form Lower Silesia region.

68