Wyniki i dyskusja

3.1. Ekspresja rekombinowanego białka aaEcR-NTD

Ekspresję aaEcR-NTD badano w celu znalezienia warunków optymalnych, pozwalających na nadprodukcji dużych ilości rozpuszczalnego białka. Profil syntezy badano w różnych warunkach (różne stężenia IPTG: 1mM, 0,5mM, 0,25mM i pożywki: TB i LB; wyników nie pokazano).

Najwydajniejszą nadekspresję uzyskano w 29°C w pożywce LB, przy stężeniu induktora 0,25 mM.

Analiza wyników SDS-PAGE (Rys.1A) wykazała indukcję białka o pozornej masie cząsteczkowej 25 kDa, podczas gdy teoretyczna masa wynosi 21,5 kDa). Różnica ta często jest obserwowana w przypadku białek IDPs w elektroforezach SDS-PAGE [10].

Rys. 1. Analiza rozpuszczalności białka aaEcR-NTD w lizatach bakteryjnych w czasie ekspresji. (A) Obraz SDS-PAGE; Marker- białka standardowe (zestaw Protein Molecular Weight Marker, Fermentas); w śladach "T" obecne są

wszystkie białka lizatu komórkowego, "P"- frakcje białek nierozpuszczalnych, "S"- frakcje białek rozpuszczalnych;

próbki pobierano przed indukcją (0h) lub odpowiednio 0,5h, 1h, 2h, 3h po indukcji. Strzałką zaznaczono pasmo odpowiadające białku aaEcR-NTD. (B) Obraz po Western blot preparatów identycznych, jak na panelu (A).

A B

123

Podczas trzygodzinnej syntezy widoczny jest przyrost białka we frakcjach rozpuszczalnych. Białko obecne jest również w niewielkich ilościach we frakcjach nierozpuszczalnych. Obecność białka potwierdzono techniką Western blot (Rys.1B). Wyniki pokazały, że aaEcR-NTD jest białkiem rozpuszczalnym i niepodatnym na degradację. W kolejnym etapie ustalono optymalną metodę oczyszczania.

Rys. 2. Oczyszczanie rekombinowanego białka aaEcR-NTD. (A) Przykładowy chromatogram z oczyszczania aaEcR-NTD przy użyciu złoża Co2+-TALON. Zielonym kolorem zaznaczono obszar, z którego pobierano frakcje i poddawano analizie SDS-PAGE (poszczególne frakcje opisano nad obszarami). (B) Przykładowy chromatogram z

oczyszczania aaEcR-NTD z użyciem kolumny Superdex75. Kolorami: jasnym i ciemnym niebieskim zaznaczono obszar, z którego pobierano frakcje i poddawano analizie SDS-PAGE (poszczególne frakcje opisano nad obszarami) (C) Obraz SDS-PAGE frakcji z pierwszego etapu oczyszczania przy użyciu złoża Co2+-TALON. Poszczególne ślady oznaczają: M - roztwór białek standardowych (PMWM) do SDS-PAGE (Fermentas); S-frakcja białek rozpuszczalnych ekstraktu bakteryjnego uzyskanego po 3h indukcji IPTG; FT- frakcja białek niewiążących się do złoża TALON; FT300 i FT’300 - szczytowa frakcja białek związanych niespecyficznie do złoża TALON; Im5, Im15, Im20- frakcje szczytowe

pobrane podczas przepłukiwania złoża buforem o stężeniu imidazolu (Im) 5, 15, 20; Im200-preparaty zawierające białka zwolnione ze złoża TALON z użyciem 200 mM imidazolu (B15-C5)- kolejno zebrane frakcje piku. (C*) Obraz po Western blot preparatów identycznych, jak na panelu (C). (D) Obraz SDS-PAGE frakcji po sączeniu molekularnym.

Poszczególne ślady oznaczają kolejno zebrane frakcje pików z sączenia molekularnego; frakcje A12-A14 uznano za czysty preparat białka EcR-NTD (~90%). (D*) Obraz po Western blot preparatów identycznych, jak na panelu (D).

C D

C* D*

A B

124

3.2. Optymalizacja procedury oczyszczania aaEcR-NTD

Aby przeprowadzić badania biochemiczne, ustalono wydajną, dwuetapowa procedurę oczyszczania. Białko aaEcR-NTD posiada na N-końcu znacznik 6xHis, dlatego pierwszym etapem była chromatografia metalopowinowactwa z użyciem złoża Co²⁺ TALON. Złoże przemywano buforem o różnym stężeniu imidazolu (5, 15, 20 mM) stosując gradient skokowy. Na każdym etapie zbierano frakcje i analizowano za pomocą SDS-PAGE i Western Blot (Rys.2A i C). Analiza wykazała, że optymalnym stężeniem, pozwalającym na wymycie zanieczyszczeń bez utraty białka jest 20mM (Rys.2 A; linia Im20), a czystość preparatu po pierwszym etapie wynosiła około 60%.

Aby oddzielić białko od zanieczyszczeń zastosowano filtrację żelową jako drugi etap oczyszczania.

Wybrano kolumnę Superdex75 rozdzielającą białka w zakresie od 3 do 70 kDa. Frakcje z tego etapu również analizowano za pomocą SDS-PAGE i Western Blot (Rys.2B i D). Czystość końcowego preparatu białkowego wyniosła około 90%.

4. Podsumowanie

Uzyskano pochodną wektora pQE-80L zawierającą cDNA kodujący aaEcR-NTD.

Zoptymalizowano warunki ekspresji, które pozwoliły na otrzymanie rozpuszczalnego rekombinowanego białka aaEcR-NTD. Ustalono również dwuetapową, wydajną procedurę oczyszczania, dzięki której otrzymano preparat białkowy o czystości około 90%. Pozwoli to na dalsze badania pod kątem biofizycznym i biochemicznym.

Praca była finansowana z dotacji Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego na działalność statutową Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej.

Literatura

[1] Gronemeyer, H and Laudet, V. Nuclear receptor facts book. Academic Press, London. 2001.

[2] Yao, TP, et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and Ultraspiracle genes.

Nature. 1993 , Vol. 366(6454), 476-9.

[3] Talbot, WS. Drosophila tissues with different metamorphic responses to ecdysone express different ecdysone receptor isoforms. Cell . 1993, Vol. 73, 1323–1337.

[4] Bocquel, MT, et al. The contribution of the N- and C-terminal regions of steroid receptors to activation of transcription is both receptor and cell-specific. Nucleic Acids Res. 1989, Vol.

17(7), 2581-95.

[5] Warnmark, A, et al. Activation functions 1 and 2 of nuclear receptors: molecular strategies for transcriptional activation. Mol Endocrinol. 2003, Vol. 17(10), 1901-9.

[6] Tompa, P. The interplay between structure and function in intrinsically unstructured proteins.

FEBS Lett. 2005, Vol. 579(15), 3346-54.

[7] Wang Sheng-Fu, Ayer, S, et al. Molecular Determinants of Differential Ligand Sensitivities of Insect Ecdysteroid Receptors. Molecular And Cellular Biology. 2000, Vol. 20(11), 3870–3879.

[8] Sambrook, J, Fritsch, EE and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, USA : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[9] Laemmli, UK. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970, Vol. 227, 680-685.

[10] Tompa, P. Structure and Function of Intrinsically Disordered Proteins. s.l. : Chapman & Hall, 2009.

125

S

-

A

The functional receptor for ecdysteroids is a transcription factor comprised of two nuclear receptors: the 20-hydroxyecdysone receptor (EcR) and the Ultraspiracle protein (Usp). Insects have different EcR isoforms, that exhibit diverse spatial and temporal distributions within various tissues.

Isoform specific NTDs differ in length and primary structure. Recent studies have shown that in NTD domain generally contains activation function 1 (AF1). Transactivation surface AF1 is independent of the presence of ligand and interacts with specific co-regulatory proteins and other transcription factor.

Our object of study was EcR-NTD form Aedes aegypti (aaEcR-NTD), the main vector of dengue and yellow fever. Preliminary bioinformatics analyses shows that this domain exhibited properties of Intrinsically Disordered Protein (IDP) molecule. IDPs, the new class of protein, are characterized by lack of stable unique 3D structure in a native state. Features of IDPs were reflected in an anomalous behavior of aaEcR-NTD in SDS-PAGE. We optimized protein expression in E.coli. and established efficient two-step purification procedure. Pure protein preparation will enable to characterize its biophysical and molecular properties.

126

To fold or not to fold: otolith matrix macromolecule-64