Agnieszka Bronowicka-Szydełko1, Jadwiga Pietkiewicz1, Martyna Frydel2, Cyryl Daroszewski2, Damian Gajecki2, Dawid Niżyński2, Andrzej Gamian1,3
Streszczenie: Końcowe produkty zaawansowanej glikacji (AGE) są heterogennymi związkami, dzielącymi się na trzy grupy, w zależności od ich właściwości fluorescencyjnych i zdolności do tworzenia wiązań krzyżowo-sieciujących. W prezentowanej pracy sprawdzono zdolności do tworzenia wiązań krzyżowo-sieciujących produktów otrzymanych w syntezie mioglobiny z akroleiną, glukozą lub metyloglioksalem w środowisku mikrofal.
Słowa kluczowe: AGE, glikacja, reakcja Maillarda
1. Wprowadzenie
Glikacją jest nieenzymatyczną reakcją zachodzącą pomiędzy cukrami redukującymi, bądź α-oksoaldehydami, a grupami zasadowymi białek, lipidów lub kwasów nukleinowych [1]. W jej wyniku formowane są nierozpuszczalne, trudno usuwalne z organizmu związki tzw. końcowe produkty zaawansowanej glikacji (AGE – advanced glycation end products). Glikacji najczęściej ulegają białka macierzy komórkowej (kolagen, elastyna) [2] enzymy [1] i białka osocza: albuminy i hemoglobiny [3]. Jak dotąd znane są dwa szlaki prowadzące do powstawania AGE: reakcja Maillarda [4] i reakcja Michaela [5].
AGE stanowią bardzo heterogenną grupę związków, różniących się między sobą masą cząsteczkową, właściwościami biochemicznymi, immunologicznymi i fizycznymi, a także reaktywnością. Rodzaj tworzonego produktu glikacji zależy od rodzaju i stężenia czynnika glikującego, rodzaju i stężenia białka glikowanego oraz rodzaju dostępnych reszt aminokwasowych, a także środowiska reakcji (obecności reaktywnych form tlenu, czy panującego w komórce ciśnienia parcjalnego) [6]. Obecnie przyjmuje się, że AGE dzielą się na trzy grupy związków klasyfikowanych względem właściwości fluorescencyjnych AGE i ich zdolności do tworzenia wiązań krzyżowo-sieciujących: 1) związki nietworzące wiązań krzyżowo-sieciujących niemające właściwości fluorescencyjnych (ang. non-cross-linking species) [7]: 2) związki tworzące wiązania krzyżowo-sieciujące mające właściwości fluorescencyjne (ang. fluorescent cross-links species) [8]
oraz 3) związki tworzące wiązania krzyżowo-sieciujące, niemające właściwości fluorescencyjnych (ang. non-fluorsecent cross-linking species) [8].
1Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław, e-mail: agaszydelko@gmail.com
2Studenci Medycyny Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu, ul. Pasteura 1, 50-367 Wrocław, e-mail: damian.gajecki@gmail.com
3Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław, e-mail: gamian@iitd.pan.wroc.pl
151
W przedstawionej pracy pokazano, że trzy wybrane mieszaniny AGE zawierają produkty usieciowane oraz określono ich masy cząsteczkowe. Mieszaniny te otrzymano w wyniku reakcji białka modelowego – mioglobiny z mięśni poprzecznie prążkowanych konia (MB) z trzema różnymi czynnikami glikującymi: akroleiną (ACR), metyloglioksalem (MGO) oraz glukozą (GLC).
Reakcje prowadzono w warunkach bezwodnych w środowisku mikrofal [9].
ACR jest czynnikiem glikującym odpowiedzialnym głównie za glikacje egzogenne w szlaku addycji Michaela – AGE są tworzone podczas pieczenia, smażenia i procesów karmelizacji.
Wykazano również, że istnieje endogenna ACR, będąca jednym z metabolitów siarczku diallilu, powstającego podczas przemian allilu w wątrobie [10]. Z kolei MGO jest fizjologicznym α-oksoaldehydem formowanym jako produkt uboczny np. z 3-aminoacetonu w katabolizmie treoniny, podczas peroksydacji lipidów, a także przy niedoborze izomerazy fosfotriozowej (bądź innych zaburzeń glikolizy) prowadząc do nagromadzenia się w komórkach nietrwałego fosforanu dihydroksyacetonu, ulegającego hydrolizie do MGO [11]. Glikacja przez MGO prowadzi do wytwarzania na modyfikowanych białkach epitopów: karboksyetylolizyny [12, 13], imidazolonów [14], argpirymidyny [15] oraz tzw. związków MOLD (związki posiadające imidazolowe wiązania solne typu metyloglioksal-lizyna) [16]. GLC jest natomiast najlepiej przyswajalnym przez ssaki monosacharydem, odpowiedzialnym głównie za glikację hemoglobiny. Warto zaznaczyć, że autoutlenianie GLC zachodzące w ustroju prowadzi do tworzenia karboksymetylolizyny – jak dotąd najlepiej poznanego epitopu glikacyjnego [17]. Podsumowując - w celu przeprowadzenia badań czynniki glikujące dobrano tak, by formowane AGE tworzyły możliwie różne rodzaje mieszanin produktów glikacji.
2. Materiały i Metody
2.1. Synteza mieszanin związków AGE
Do syntezy związków AGE, jako białka modelowego, użyto mioglobiny (MB) z mięśni poprzecznie prążkowanych konia (Sigma-Aldrich) oraz trzech różnych czynników glikujących:
akroleiny (ACR), glukozy (GLC) i metyloglioksalu (MGO). Białko to nie wymagało dodatkowego oddzielania od wysokospolimeryzowanych produktów (które są często obecne w przypadku preparatów handlowych albuminy surowiczej). MB ma stosunkowo niską masę cząsteczkową (ok.
17 kDa), co pozwala na uzyskiwanie średnio-usieciowanych produktów AGE. Reakcje prowadzono w warunkach bezwodnych w reaktorze mikrofalowym (Able&Jasco) otrzymując trzy mieszaniny produktów AGE: 1) MB-ACR (relacja molowa 1/32, 75oC, 10 min.); 2) MB-GLC (relacja molowa 1/300, 75oC, 15 min.); oraz 3) MB-MGO (relacja molowa 1/3.2, 75oC, 10 min.), które rozpuszczono w PBS, pH 7.4 (LabEmpire).
2.2. Elektroforeza SDS – PAGE
Masy produktów znajdujących się w mieszaninach: 1) MB-ACR; 2) MB-GLC oraz 3) MB-MGO analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, prowadzonej w 12% żelu
poliakrylamidowym [18]. Na ścieżki żelu nanoszono próby o objętości 20 μL, zawierające ok. 10 µg białka zmodyfikowanego przez dany czynnik glikujący, zawieszonego w buforze próbkowym (0.06 M Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 0.025% błękit bromofenolowy, 5% β-merkaptoetanol). Kontrolę stanowiła próba zawierająca 2 µg handlowego preparatu MB.
Elektroforezę prowadzono w warunkach stałego natężenia 30 mA przez 2.5 godziny. Do wybarwiania białek w żelu używano 0.25% Coomassie Brillant Blue R-250 (PARK). Do odbarwienia tła w żelach używano tzw. odbarwiacza do żeli – wodnego roztworu zawierającego 50
152
mM metanol i 75 mM kwas octowy. Wyniki analizowano w systemie do detekcji i analiz żeli i blotów (Bio-Rad) w programie GelDok.
3. Wyniki i Wnioski
3.1. Elektroforeza SDS-PAGE
Przeprowadzona elektroforeza SDS-PAGE i analiza żelu, na którego ścieżki nałożono mieszaniny produktów MB-ACR, MB-GLC, MB-MGO oraz próbę niezmodyfikowanej MB, potwierdziła, że synteza prowadzona w reaktorze mikrofalowym w wybranych warunkach pozwala na otrzymywanie mieszanin zawierających AGE o różnych masach cząsteczkowych (Rys. 1A).
Analiza żelu przeprowadzona w programie GelDok (Bio-Rad) pozwoliła na określenie procentowej zawartości poszczególnych AGE w danej mieszaninie poreakcyjnej (Rys. 1B-D).
Rys. 1. Analiza produktów otrzymanych w syntezie mikrofalowej. A) analiza żelu otrzymanego w elektorforezie SDS-PAGE – na ścieżki nałożono odpowiednio: 1 – standard białkowy Gene Ruler Dual Color (Bio-Rad), 2 – mioglobina z preparatu handlowego (SIGMA-ALDRICH), 3 – mieszanina produktów MB-ACR , 4 – mieszanina
produktów MB-GLC, 5 – mieszanina produktów MB-MGO; B) Procentowa zawartość poszczególnych AGE o określonych masach molekularnych w mieszaninie MB-ACR; C) Procentowa zawartość poszczególnych AGE o określonych masach molekularnych w mieszaninie MB-GLC; D) Procentowa zawartość poszczególnych AGE
o określonych masach molekularnych w mieszaninie MB-MGO
153
Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że zarówno akroleina jak i metyloglioksal w czasie glikacji z mioglobiną prowadzą do formowania usieciowanych AGE,
natomiast mieszanina MB-GLC (pomimo 300-krotnego nadmiaru molowego GLC w stosunku do MB) zawierała aż w 98 % produkty nieusieciowane. Glikacja z udziałem akroleiny pozwoliła na uzyskanie mieszaniny zawierającej w 49 % usieciowane AGE (w tym 11% wysokousieciowanych, mających masy cząsteczkowe powyżej 220 kDa i 38% średnio-usieciowanych, o masach 26 – 138 kDa). Zauważono również, że w wybranych warunkach reakcji powstaje 8 różnych MB-ACR o odmiennych masach molekularnych. Glikacja za pomocą metyloglioksalu również prowadziła do powstawania usieciowanych AGE, choć ich udział w stosunku do produktów nieusieciowanych był niższy niż w mieszaninie MB-ACR i wynosił 22 %.
3. Podsumowanie
Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że produkty AGE obecne w mieszaninach MB-ACR i MB-MGO należą do 2 grupy związków AGE (tworzące wiązania krzyżowo-sieciujące, mające właściwości fluorescencyjne) lub 3 grupy związków AGE (tworzące wiązania krzyżowo-sieciujące, nie mające właściwości fluorescencyjnych). Glikacja MB za pomocą GLC prowadzi natomiast do otrzymywania mieszaniny AGE niezdolnych do tworzenia wiązań krzyżowo-sieciujących, a tym samym należących do 1 grupy związków AGE (związki nie tworzące wiązań krzyżowo-sieciujących, a w konsekwencji nie mające właściwości fluorescencyjnych). W celu precyzyjnej kwalifikacji zsyntetyzowanych AGE należało jeszcze sprawdzić ich właściwości fluorescencyjne – co przedstawiono w części B publikacji.
Literatura
[1] J. Pietkiewicz, A. Bronowicka-Szydełko, K. Dzierzba, R. Danielewicz, A. Gamian. Glycation of the muscle-specific enolase by reactive carbonyls: effect of temperature and the protection role of carnosine, pirydoxamine and phosphatidylserine. Protein J. 30(3): 149-158, 2011.
[2] A. Kuzan, A. Bronowicka-Szydełko, A. Chwiłkowska, K. Maksymowicz, A. Gamian, M.
Kobielarz, C. Pezowicz. Wykrywanie obecności końcowych produktów zaawansowanej glikacji (AGE) w tętnicach z różnym stopniem zaawansowania zmian miażdżycowych.
W:Interdyscyplinarność badań naukowych 2012: praca zbiorowa; pod red. Jarosława Szreka;
Wrocław: Ofic. Wydaw. Politechniki Wrocławskiej; s.112-115, ISBN 978-83-7493-677-4, 2012.
[3] A. Bronowicka-Szydełko, J. Pietkiewicz, A. Gamian. Własności hemolityczne produktów zaawansowanej glikacji albuminy surowiczej. W:Interdyscyplinarność badań naukowych 2010:
praca zbiorowa [CD-ROM] ; pod red. Jarosława Szreka; Wrocław: Ofic. Wydaw. Politechniki Wrocławskiej; s.28-33, ISBN 978-83-7493-520-3, 2010.
[4] L.C. Maillard LC. Action des acides amines sur les sucres: formation des melanoidines par voie methodique. C R Acad Sci 154:66–68, Paryż 1912.
[5] S.K. Ray, S. Rout, VK. Singh. Enantioselective synthesis of 3,4-dihydropyran derivatives via a Michael addition reaction catalysed by chiral pybox-diph-Zn(ii) complex. Org Biomol Chem.
[Epub ahead of print], 2013.
[6] S.Y. Goh, ME. Cooper. The role of advanced glycation end products in progression and complications of diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 93(4):1143-1152, 2008.
[7] K. Ikeda, T. Higashi, H. Sano, Y. Jinnouchi, M. Yoshida, T. Araki, S. Ueda, S. Horiuchi. Nε -(carboxymethyl)lysine protein adduct is a major immunological epitope in proteins modified
154
with advanced glycation end products of the Maillard reaction. Biochem.18:35(24):8075-8083, 1996.
[8] D.R. Sell, VM. Monnier. Structure elucidation of a senescence cross-link from human extracellular matrix. J Biol Chem 264:21597–21602, 1989.
[9] A. Bronowicka-Szydełko, J. Pietkiewicz, A. Gamian. Synteza wysokocząsteczkowego produktu zaawansowanej glikacji (AGE). W:Interdyscyplinarność badań naukowych 2012: praca zbiorowa; pod red. Jarosława Szreka; Wrocław: Ofic. Wydaw. Politechniki Wrocławskiej, 2012; s.158-161, ISBN 978-83-7493-677-4, 2012.
[10] D. Truong, W. Hindmarsh, PJ. O'Brien. The molecular mechanisms of diallyl disulfide and diallyl sulfide induced hepatocyte cytotoxicity. Chem Biol Interact. 180 (1): 79-88,
doi:10.1016/j.cbi.2009.02.008. PMID 19428347, 2009.
[11] P. Mader, E. Szãkovã, E. Èurdová, Combination of classical dry ashing with stripping voltammetry in trace element analysis of biological materials: review of literature published after 1978.Talanta, 43(4):521-34, 1996.
[12] M.U. Ahmed, E.B. Frye, T.P. Degenhardt, S.R. Thorpe, J.W. Baynes. Nε-(carboxyethyl)lysine, a product of the chemical modification of proteins by methylglyoxal, increases with age in human lens proteins. Biochem. J 324: 565-570, 1997.
[13] T.P. Degenhardt, S.R. Thorpe, J.W. Baynes. Chemical modification of proteins by methylglyoxal. Cell. Mol. Biol. 44:1139-1145, 1998.
[14] M.E. Westwood, OK. Argirov, E.A. Abordo, P.J. Thornalley. Methylglyoxal-modified arginine residues a signal for receptor-mediated endocytosis and degradation of proteins by monocytic THP-1 cells. Biochim. Biophys. Acta 1356: 84-94, 1997.
[15] T. Oya, N. Hattori, Y. Mizuno, S. Miyata, S. Maeda, T. Osawa, K. Uchida. Methylglyoxal modification of pro tein. Chemical and immunochemical characterization of methylglyoxal-arginine adducts. J. Biol. Chem. 274: 18492-18502, 1999.
[16] E.B. Frye, T.P. Degenhardt, S.R. Thorpe, JW. Baynes. Role of the Maillard reaction in aging of tissue proteins. Advanced glycation end product-dependent increase in imidazolium cross-links in human lens proteins. J. Biol. Chem. 273: 18714-18719, 1998.
[17] S. Yoshida, K. Yamada, K. Hamaguchi, M. Nishimura, E. Hatakeyama, H. Tsuchida, K.
Sakamoto, H. Kashiwabara, T. Yokoyama , K. Ikeda, S. Horiuchi. Immunohistochemical study of human advanced glycation end-products (AGE) and growth factors in cardiac tissues of patients on maintenance dialysis and with kidney transplantation. Clin. Nephrol. 49:273-280, 1998.
[18] U.K. Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685, 1970.
Podziękowanie:
Praca realizowana jest w ramach projektu systemowego pn. „Przedsiębiorczy doktorant –inwestycja w innowacyjny rozwój regionu” (Program Operacyjny Kapitał Ludzki, Priorytet VIII: Regionalne Kadry Gospodarki, Działanie 8.2 Transfer Wiedzy, Poddziałania 8.2.2 Regionalne Strategie
Innowacji). Projekt współfinansowany z Unii Europejskiej i Europejskiego Funduszu Społecznego.
155