Jadwiga Pietkiewicz1, Agnieszka Bronowicka-Szydełko1, Damian Gajecki2, Dawid Niżyński2, Martyna Frydel2, Cyryl Daroszewski2, Andrzej Gamian1,3
Streszczenie: W pracy przedstawiono badania potwierdzające lub negujące zdolności do fluorescencji produktów glikacji obecnych w trzech różnych mieszaninach AGE (advanced glycation end products), otrzymanych w syntezie mikrofalowej. Przeprowadzone badania pozwoliły na klasyfikację tych produktów glikacji zgodnie z obowiązującą nomenklaturą.
Słowa kluczowe: AGE, fluorescencja, glikacja
1. Wprowadzenie
Fluorescencja jest szybkim procesem fotofizycznym (10-8 s), polegającym na emisji fotonu w celu dostarczenia energii do aktywacji cząsteczki bądź atomu poprzez pokonanie bariery aktywacji w procesie fotochemicznym i przejścia elektronu na wyższy poziom oscylacyjny. W przeciwieństwie do znacznie wolniejszego procesu fosforescencji, fluorescencja nie powoduje zmiany multipletowości zachodzącej w obrębie obsadzeń singletowych [1]. Wiele substancji biologicznie czynnych wykazuje zdolności do fluorescencji, np. aminokwasy aromatyczne:
tryptofan, tyrozyna, fenyloamina, zasady nukleinowe: adenina, guanina, cytozyna, tymina i uracyl, a także barwniki roślinne: chlorofile, bakteriochlorofile, karotenoidy, witaminy i hormony: np.
ryboflawina. Dzięki temu związki te można w prosty i szybki sposób odróżnić od pozostałych lub potwierdzić ich obecność w badanej mieszaninie.
Zauważono że końcowe produkty zaawansowanej glikacji AGE (ang. advanced glycation end products), powstające w wyniku nieenzymatycznej reakcji Maillarda [2] lub Michaela [3] mogą również mieć zdolności do fluorescencji. Glikacja zachodząca pomiędzy cukrami redukującymi bądź reaktywnymi aldehydami, a grupami zasadowymi łańcuchów bocznych aminokwasów może prowadzić do tworzenia się wiązań krzyżowo-sieciujących, które mogą nadawać właściwości fluorescencyjne tworzonym AGE. Znana jest również grupa takich AGE, które pomimo obecności wiązań krzyżowo-sieciujących nie mają właściwości fluorescencyjnych. Warto zaznaczyć, że jak dotąd nie scharakteryzowano żadnego takiego produktu glikacji, który pomimo nieobecności wiązań krzyżowo-sieciujących wykazywałby się zdolnością do fluorescencji. Dlatego też w obecnie przyjętej klasyfikacji tych związków brana jest pod uwagę zarówno obecność wiązań krzyżowo-sieciujących jak i ich zdolności do fluorescencji. Przyjmuje się, że pierwszą grupę AGE stanowią związki nie mające właściwości fluorescencyjnych, w których nie występują wiązania krzyżowo-sieciujące, drugą te, które mają zarówno zdolności do fluorescencji jaki wykazują się obecnością
1Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław, e-mail: agaszydelko@gmail.com
2Studenci Medycyny Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu, ul. Pasteura 1, 50-367 Wrocław, e-mail: damian.gajecki@gmail.com
3Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław, e-mail: gamian@iitd.pan.wroc.pl
157
wiązań sieciujących, natomiast trzecią te, które pomimo obecności wiązań krzyżowo-sieciujących nie mają zdolności do fluorescencji.
Intensywna glikacja białek zachodzi w warunkach chronicznej hiperglikemii. Powstawanie AGE jest nasilone w warunkach stresu oksydacyjnego [4], który prowadzi do samoutlenienia m.in.
glukozy. Źródłem AGE może być również dieta, czy palenie tytoniu. Wzrost ich poziomu w ustroju może być spowodowany uszkodzeniem filtracji kłębuszkowej glikowanych białek w przebiegu niewydolności nerek [5]. Badania in vitro pokazały szkodliwe efekty wywołane obecnością AGE, włączając w to mutacje, karcynogenezę i efekty cytotoksyczności [6]. Wykazano, że AGE mają udział w patogenezie zmian miażdżycowych tętnic, zwiększając tym samym stopień ryzyka wystąpienia chorób ze strony układu krążenia. Istotna jest ich rola w powikłaniach cukrzycowych – retinopatii, nefropatii, angiopatii, neuropatii [7]. Podobne zmiany pod wpływem AGE zachodzą w procesie starzenia [8].
Końcowe produkty zaawansowanej glikacji, które uległy akumulacji w tkankach, dzięki właściwościom fluorescencyjnym mogą zostać wykryte podczas biopsji tkanek [4]. Metody detekcji i badania poziomu AGE opierające się na autofluorescencji można wykorzystać do oznaczania zawartości tych związków w surowicach, czy skórze [9]. Produkty glikacji o właściwościach fluorescencyjnych można wykrywać wzbudzając je w zakresie fal UV (300-420 nm), a następnie emitowany sygnał monitorować w zakresie fal 320-600 nm [4].
Przedmiotem tej pracy jest synteza i badanie własności molekularnych i fluorescencyjnych produktów glikacji białka modelowego – mioglobiny, przez glukozę (GLC), metyloglioksal (MGO) oraz akroleinę (ACR). W części 1 została zidentyfikowana obecność wiązań krzyżowo-sieciujących w mieszaninach produktów: MB-ACR, MB-GLC i MB-MGO, natomiast w tej części pracy mieszaniny te zostały poddane fluorescencji w czterech różnych warunkach wzbudzenia i emisji sygnału.
2. Materiały i metody
2.1. Synteza mieszanin związków AGE:
Syntezę AGE przeprowadzono tak, jak opisano to w części 1 publikacji.
2.2. Określenie właściwości fluorescencyjnych otrzymanych mieszanin:
Eksperymentowi poddano mieszaniny produktów AGE: 1) MB-ACR; 2) MB-GLC oraz 3) MB-MGO otrzymane w syntezie mikrofalowej o stężeniu 1 mg/mL każda, rozpuszczonych w PBS, pH 7.4. Roztwory poszczególnych mieszanin nakładano na płytkę Nunc w trzech powtórzeniach każdy, a tło stanowił PBS, pH 7.4., nałożony również w 3 powtórzeniach. Widma fluorescencyjne sporządzano w zakresie: 280-600 nm na podstawie odczytów w czytniku płytek (LabEmpire, PERKIN ELMER). Długości fal wzbudzenia i emisji dobrano na podstawie Rasheed i wsp. [10].
Intensywność emisji fluorescencji była średnią arytmetyczną z danego punktu pomiarowego.
Zakres odczytu podzielono na 4 przedziały:
1) wzbudzenie: 280 nm; emisja: 300-430 nm 2) wzbudzenie: 300 nm; emisja: 320-450 nm 3) wzbudzenie: 340 nm; emisja: 360-500 nm 4) wzbudzenie: 465 nm; emisja: 485-600 nm
158
3. Wyniki i wnioski
3.1. Określenie właściwości fluorescencyjnych otrzymanych mieszanin:
Uzyskane mieszaniny AGE: MB-ACR, MB-GLC i MB-MGO wykazywały zróżnicowane właściwości fluorescencyjne (Rys. 1). Po wzbudzaniu badanych próbek (o stężeniach 1 mg/mL) światłem o długości fali 280 nm (Rys. 1) zaobserwowano najwyższą intensywność fluorescencji dla mieszaniny MB-MGO (maksymalna wartość intensywności fluorescencji: 2569 a.u.) i nieco niższą dla mieszaniny MB-ACR (maksymalna wartość 2331 a.u.). Choć profile zmiany intensywności fluorescencji w zależności długości fali w zakresie emisji 300 – 430 nm dla obu tych mieszanin miały podobny kształt, to ich maksima były względem siebie przesunięte – maksymalna wartość intensywności fluorescencji dla mieszaniny MB-MGO przypadała na długość fali 354 nm, a dla MB-ACR na 358 nm. Mieszanina MB-GLC maksymalną intensywność fluorescencji (694 a.u.) osiągała dla 339 nm. Niskie wartości intensywności emisji fluorescencyjne dla tej mieszaniny świadczą o tym, że mieszanina ta zawierała AGE o słabych właściwościach fluorescencyjnych (Rys 1).
Rys. 1. Widmo fluorescencyjne w zakresie emisji: 300-430 nm trzech mieszanin produktów AGE: MB-ACR, MB-GLC i MB-MGO otrzymane po wzbudzeniu falą o długości 280 nm
Po wzbudzaniu badanych próbek (o stężeniach 1 mg/mL) światłem o długości fali 300 nm (Rys.
2) maksymalne wartości intensywności fluorescencji dla mieszanin MB-MGO i MB-ACR wynosiły odpowiednio 1925 a.u. (dla 340 nm) i 1871 a.u (dla 338 nm). Oba profile zależności intensywności fluorescencji od długości fali przy wzbudzeniu światłem o długości 300 nm w zakresie emisji 320 – 450 nm pokrywały się. Maksymalna intensywność fluorescencji (847 a.u.) dla mieszaniny produktów MB-GLC przypadała dla fali o długości 337 nm. Profil zmiany intensywności fluorescencji od długości fali w badanym zakresie fal dla tej mieszaniny wskazał na słabe właściwości fluorescencyjne produktów glikacji formowanych przez glukozę.
0,0 500,0 1000,0 1500,0 2000,0 2500,0 3000,0
300 307 314 321 328 335 342 349 356 363 370 377 384 391 398 405 412 419 426
Intensywność fluorescencji [a.u.]
λ [nm]
MB-MGO MB-GLC MB-ACR
159
Rys. 2. Widmo fluorescencyjne w zakresie emisji: 320-450 nm trzech mieszanin produktów AGE: MB-ACR, MB-GLC i MB-MGO otrzymane po wzbudzeniu falą o długości 300 nm
Po wzbudzaniu badanych próbek światłem o długości fali 340 nm lub 465 nm obserwowano emisję fluorescencji odpowiednio w zakresie 360 – 500 nm (Rys. 3a) lub 485 – 600 nm (Rys. 3b).
Po wzbudzeniu światłem długości 465 wartości intensywności fluorescencji dla każdej z trzech mieszanin AGE: MB-ACR, MB-GLC i MB-MGO były niskie, co świadczyło, że w tych warunkach wzbudzenia i emisji żadne z AGE obecnych w mieszaninach MB-ACR, MB-GLC i MB-MGO nie wykazywały zdolności do fluorescencji. Zastosowane długości fal dostarczały niewystarczającej energii wzbudzenia, a w konsekwencji nie została pokonana bariera aktywacji elektronu.
Rys. 3a. Widmo fluorescencyjne w zakresie emisji: 360-500 nm trzech mieszanin produktów AGE: MB-ACR, MB-GLC i MB-MGO otrzymane po wzbudzeniu falą o długości 340 nm
0,0 500,0 1000,0 1500,0 2000,0 2500,0 3000,0
320 327 334 341 348 355 362 369 376 383 390 397 404 411 418 425 432 439 446
Intensywność fluorescencji [a.u.]
λ [nm]
MB-ACR MB-GLC MB-MGO
0,0 500,0 1000,0 1500,0 2000,0 2500,0 3000,0
360 367 374 381 388 395 402 409 416 423 430 437 444 451 458 465 472 479 486 493 500
Intensywność fluorescencji [a.u.]
λ [nm]
MB-ACR MB-GLC
160
Rys. 3b. Widmo fluorescencyjne w zakresie emisji: 485-600 nm trzech mieszanin produktów AGE: MB-ACR, MB-GLC i MB-MGO otrzymane po wzbudzeniu falą o długości 465 nm
Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że glikacja MB za pomocą ACR i MGO prowadzi do otrzymania mieszanin produktów mających właściwości fluorescencyjne, w których obecne są wiązania krzyżowo-sieciujące (grupa II AGE), natomiast w wyniku glikacji za pomocą glukozy powstaje mieszanina AGE nie wykazujących właściwości fluorescencyjnych, w których, pomimo 300-krotnego nadmiaru molowego czynnika glikującego względem glikowanego białka, nie są tworzone wiązania krzyżowo-sieciujące (I grupa AGE).
Literatura
[1] J. Twardowski: Biospektroskopia, tom 3, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1990 [2] Maillard LC. Action des acides amines sur les sucres: formation des melanoidines par voie
methodique. C R Acad Sci 154:66–68, Paryż 1912
[3] S.K. Ray, S. Rout, V.K. Singh. Enantioselective synthesis of 3,4-dihydropyran derivatives via a Michael addition reaction catalysed by chiral pybox-diph-Zn(ii) complex. Org Biomol Chem.
[Epub ahead of print], 2013
[4] P. Samborski, D. Naskręt i współprac.: Assessment of skin autofluorescence as a marker of advanced glycation end product accumulation In type 1 diabetes, Department od Internal Diseases, Metabolic Disorders and Dietetics, Poznan University of Medical Sciences, Poznań, Poland 2010
[5] P. J. Thornalley. Drug Metabol Drug Interact. 23(1-2): 125-150, University of Warwick, United Kingdom 2009
[6] J.M. Silvản, J van de Lagemaat. i współprac.: Analysis and biological properties of amino acid derivates formed by Maillard reaction in foods, Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC), Madrid, Spain 2006
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
485 491 497 503 509 515 521 527 533 539 545 551 557 563 569 575 581 587 593 599
Intensywność fluorescencji [a.u.]
λ [nm]
MB-ACR MB-MGO MB-GLC
161
[7] J. Pietkiewicz, E. Seweryn, A. Bartyś, A. Gamian. Receptory końcowych produktów zaawansowanej glikacji – znaczenie fizjologiczne i kliniczne, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Akademia Medyczna we Wrocławiu, Wrocław 2008
[8] N. Nass, B. Bartling, S.A. Navarrete i współprac.: Advanced glycation end products, diabetes and ageing, Z Gerantol Geriat 40:349-356, 2007
[9] J. Leszek, M. Ferens-Sieczkowsa, I. Kątnik-Prastowska: Fluorescent advanced glycation and products in sera of Alzheimer’s disease patients. [In:] Boloyannis S.J. (editor): Perspectives in Neurosciences: in memory of professor Agapitos Diacoyannis. Tessaloniki: Greece Society for Amelioration of the Quality of Life for Chronic Neurologic Patients, 373-381, 2005
[10] Z. Rasheed, A.N. Anbazhagan, N. Akhtar, S. Ramamurthy, F.R. Voss, T.M. Haqqi. Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate inhibits advanced glycation end product-induced expression of tumor necrosis factor-α and matrix metalloproteinase-13 in human chondrocytes, 2011
Podziękowanie:
Praca realizowana jest w ramach projektu systemowego pn. „Przedsiębiorczy doktorant –inwestycja w innowacyjny rozwój regionu” (Program Operacyjny Kapitał Ludzki, Priorytet VIII: Regionalne Kadry Gospodarki, Działanie 8.2 Transfer Wiedzy, Poddziałania 8.2.2 Regionalne Strategie
Innowacji). Projekt współfinansowany z Unii Europejskiej i Europejskiego Funduszu Społecznego.