Joanna A. Wawryka1, Aleksandra Gonera1, Kajetan P. Kawecki1, Anna K. Sobkowicz1, Katarzyna Bieżuńska-Kusiak2
Streszczenie: W pracy została oceniona ekspresja receptora kwasu foliowego (FR).
Izoforma α (FRA) badanego receptora jest białkiem błonowym i wykazuje zwiększoną ekspresję w liniach nowotworowych pochodzenia nabłonkowego. Do badań użyto nowotworowe linie komórkowe: SKOV 3 (rak jajnika oporny na cis-platynę, adriamycynę), SW 626 (trzecie stadium raka jajnika), MCF-7/DOX (rak gruczołu sutkowego wrażliwy na TNFα, oporny na doksorubicynę), komórki czerniaka Me45 oraz linię prawidłową keratynocytów HaCaT. Do oceny ekspresji receptora kwasu foliowego zastosowano technikę immunocytochemiczną ABC.
Słowa kluczowe: receptor kwasu foliowego, rak jajnika, czerniak, gruczolakorak sutka
1. Wstęp
Kwas foliowy, występuje w różnych formach. Jego zasadniczą funkcją jest przenoszenie aktywnych grup jednowęglowych między związkami. Ma ogromny udział w przemianach aminokwasów (seryny i glicyny, metioniny i homocysteiny oraz histydyny) oraz syntezie puryn i pirymidyn [1]. Ponadto bierze udział w syntezie, naprawie i metylacji DNA [2].
Kwas foliowy (witamina B9) zbudowany jest z zasady pterydynowej, kwasu p-aminobenzoesowego (PABA) oraz kwasu glutaminowego [3]. Kwas foliowy i jego pochodne należą do grupy folianów i różnią się między sobą stopniem utlenienia pierścienia pterydyny oraz liczbą reszt kwasu glutaminowego (od 1 do 11) [4]. Związki te charakteryzują się podobną aktywnością biologiczną, przy czym kwas foliowy jest najbardziej stabilnym i najlepiej przyswajalnym związkiem z tej grupy [2].
Dihydrofolian (DHF) i tetrahydrofolian (THF) to formy witaminy pochodzące z naturalnych źródeł. W jelicie cienkim absorbowane są jedynie formy monoglutaminowe, powstają one wskutek dekoniugacji [5]. W docelowych komórkach dochodzi do ich ponownej koniugacji do postaci poliglutaminowych. Umożliwia to gromadzenie ich w komórce, gdyż silnie anionowe związki nie są w stanie przenikać przez błonę komórkową na zewnątrz. Rezerwuarem kwasu foliowego w postaci pentaglutaminowej jest wątroba [2].
Kwas foliowy jest wiązany przez komórkę dzięki wysoce swoistemu (KD ≈ 1nM) receptorowi błonowemu (FR) [6], po przyłączeniu do którego dostaje się do komórki drogą internalizacji i endocytozy [7,8]. FR jest białkiem powierzchniowym zbudowanym z jednego łańcucha polipeptydowego, związanego z błoną przez glikozylofosfatydyloinozytol (kotwicę GPI) [7,9]. FR jest wykorzystywany do pobierania kwasu foliowego, kiedy jego dostępność jest niewielka – w przeciwnym razie w jego absorpcji uczestniczy ATP-zależny przenośnik zredukowanych folianów [10].
Charakteryzują go dwie izoformy FR: α (FRA) o masie 38kDa oraz β (FRB) o masie 34 kDa. Występują również izoformy δ (FRD) i γ (FRG) [9].
1 Wydział Lekarski, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, SKN przy Katedrze i Zakładzie Biochemii Lekarskiej, 50-368 Wrocław ul. Chałubińskiego 10, annamarcinkowska@op.pl
2 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, biochsek@bioch.am.wroc.pl
167
Naturalnie występującą ekspresję receptorów FRA obserwuje się jedynie w kilku tkankach i narządach (nerkach, płucach, śliniankach, łożysku i splocie naczyniówkowym), tylko na biegunie szczytowym spolaryzowanych komórek nabłonkowych [7,9].
FRB obserwuje się jako produkt selektywnej ekspresji w aktywowanych makrofagach w zapaleniach, chorobach autoimmunologicznych [6] oraz w nowotworach pochodzenia nienabłonkowego [11]. Obecność izoformy β stwierdza się w łożysku [11].
Właściwości FRA jako białka wysoce skutecznie wychwytującego kwas foliowy pozwala założyć związek ich stopnia ekspresji z wartością zapotrzebowania na kwas foliowy do syntezy, metylacji i naprawy DNA [7,9]. Komórki szybko rosnące (w tym transformowane nowotworowo) będą więc wymagać dostarczenia większej ilości folianów. Zwiększona ilość FR umożliwia im pobieranie folianów ze środowiska ubogiego w te związki, a przez to zapewnia komórkom nowotworowym dalszy wzrost.
W liniach komórkowych nie wszystkich nowotworów dochodzi do nadekspresji FRA.
Pozwala to zauważyć zależność występowania nadekspresji FRA tylko w nowotworach pochodzenia nabłonkowego [6-9]. Do takich należą: nieśluzówkowy rak jajnika i endometrium, rak szyjki macicy, rak gruczołu sutkowego, niedrobnokomórkowy rak płuc, jasnokomórkowy rak nerki, rak odbytu [6,9].
Receptor kwasu foliowego ze względu na specyfikę występowania może być markerem komórkowym, a jego nadekspresja określa fenotyp komórek nowotworowych [12]. Ponadto mechanizm jego działania pozwala na stosowanie swoiście działających koniugatów leków z kwasem foliowym przeciwko komórkom nowotworowym wykazującym dużą ilość tych receptorów, a także może być stosowany w obrazowaniu metodami PET, SPECT i MRI [6,8].
FRB wykazuje mniejsze powinowactwo do innych niż N5-formylotetrahydrofolian i N5-metylotetrahydrofolian koenzymów oraz antyfolianów. Dlatego znakowane kwasem foliowym cytostatyki dostają się do docelowych komórek przede wszystkim przez FRA [11] i z tego powodu stały się głównym obiektem naszego zainteresowania.
2. Materiały i metody.
2.1.Hodowla komórkowa.
Badania wykonano na pięciu liniach komórkowych:
1. SKOV 3 - ludzka linia komórkowa raka jajnika, zakupiona w firmie ATCC. Linia oporna na cis-platynę, adriamycynę i toksynę błoniczą.
2. SW 626 - ludzka linia komórkowa raka jajnika, zakupiona w firmie ATCC.
3. MCF-7/DOX - ludzka linia opornego na doksorubicynę gruczolakoraka gruczołu sutkowego, użyczona do badań przez Centrum Onkologii Marii Curie Skłodowskiej z Gliwic.
4. Me45 - ludzka linia komórkowa czerniaka złośliwego wyprowadzona z przerzutu do węzła chłonnego, użyczona do badań przez Centrum Onkologii Marii Curie Skłodowskiej z Gliwic.
5. HaCaT – prawidłowa, transfekowana, nieśmiertelna ludzka linia keratynocytów.
Hodowlę komórkową prowadzono w plastikowych butelkach (25 cm2, Falcon), w płynie hodowlanym DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Sigma-Aldrich), zawierającym 2mM glutaminy. Płyn uzupełniono 10% cielęcą surowicą płodową - FBS (Fetal Bovine Serum, Sigma-Aldrich) oraz w 50 μg/ml streptomycyny (Sigma-Sigma-Aldrich). Linie komórkowe inkubowano w temperaturze 37°C w obecności 5% CO2. Medium hodowlane wymienieniano dwa razy w tygodniu. Po osiągnięciu pełnej monowarstwy komórki odklejano od podłoża stosując 0,25%
roztwór trypsyny z EDTA (Sigma-Aldrich) i wykorzystano do badań.
168
2.2.Ocena ekspresji receptorów kwasu foliowego metodą immunocytochemiczną ABC
Do badania ekspresji FRs wykorzystano technikę immunocytochemiczną ABC (strept(awidyna)-biotynylowana peroksydaza). Komórki nowotworowe hodowano na szkiełkach ośmiodołkowych (Diagnostic Microscope Slides, Erie).
Do reakcji zastosowano specyficzne przeciwciała przeciwko receptorom kwasu foliowego FR (FL-257) (sc-28997, poliklonalne przeciwciało IgG królika; Santa Cruz Biotechnology) w rozcieńczeniu 1:100. Reakcję barwienia przeprowadzono DAB, jądra wyznakowano hematoksyliną, preparaty zamykano żywicą syntetyczną DPX i oceniano w mikroskopie prostym (Olympus BX51).
3. Wyniki
Ocenę ekspresji FRs dokonano metodą półilościową przy użyciu mikroskopu Olympus BX51. Policzono procentową ilość komórek pozytywnie zabarwionych w obszarze wybranym przypadkowo. Brano pod uwagę po 100 komórek w trzech niezależnie wybranych polach.
Otrzymane wyniki przedstawia Tabela 1.
Tabela 1. Ekspresja FRs w liniach komórkowych SKOV 3, SW 626, MCF-7/DOX, Me45, HaCaT. Intensywność reakcji immunocytochemicznej: - - bez zabarwienia, + - ze słabym zabarwieniem,
++ - ze średnim zabarwieniem, +++ - z silnym zabarwieniem.
Linia komórkowa
% zabarwionych komórek
Intensywność reakcji immunocytochemicznej
SKOV 3 100 % ++/+++ (błona komórkowa, cytoplazma, otoczka jądrowa) SW 626 95 – 98 % ++ (błona komórkowa, cytoplazma, otoczka jądrowa) MCF-7/DOX 97 – 99 % +/++ (powierzchna błony komórkowej)
Me45 100 % ++/+++ (otoczka jądrowa)
HaCaT 100 % ++/+++ (cytoplazma, otoczka jądrowa)
Intensywność i lokalizację reakcji immunocytochemicznej prezentują obrazy mikroskopowe badanych tkanek (Rysunek 1).
Rysunek 1. Efekt reakcji immunocytochemicznej.
169
4. Dyskusja
Zaobserwowaliśmy zróżnicowaną ekspresję FR w liniach komórek nowotworowych oraz w prawidłowej linii keratynocytów.
W linii komórkowej keratynocytów HaCaT ekspresja FR została oceniona jako średnia, a miejscami silna. Jest to transfekowana linia komórkowa o zmienionym genotypie. Jej zdolność do dyferencjacji spowodowała, że w badaniach laboratoryjnych zastąpiła normalne ludzkie keratynocyty, co dostrzegł w swej pracy Schoop [13]. Dość wysoki poziom ekspresji FR w tych komórkach można tłumaczyć tym, że kwas foliowy wpływa na metabolizm nukleotydów, które intensywnie syntezowane są w komórkach szybko dzielących się, o czym pisał w swej pracy L. E. Kelemen [14]. Dla porównania, w prawidłowej linii keratynocytów ludzkich DO33, zastosowanej do badań przez T. Mironava [15], ekspresja tych receptorów jest niższa niż w liniach keratynocytów zmienionych nowotworowo- SCC13 i SCC12B. Autorka prowadziła badania nad celowaną terapią nowotworową przy użyciu nanocząsteczek platyny opłaszczonych kwasem foliowym, które dostawały się do komórki za pośrednictwem FR, dowodząc że ich ekspresja w komórkach prawidłowych jest niższa niż w komórkach nowotworowych, a więc że podanie znakowanego cytostatyku wpłynie głównie na komórki nowotworowe.
W linii ludzkiego czerniaka Me45 ekspresja FR określona została jako duża lub średnia.
Zgadzałoby się to z badaniami prowadzonymi przez L. Sanchez-del-Campo [16], które mając wyjaśnić oporność komórek czerniaka na Metotreksat (MTX), wykazały że także w innych liniach komórkowych czerniaków ludzkich (SK-MEL-28, G-361) jak również mysich (B16 ⁄ F10) ekspresja FR jest wyższa niż w prawidłowych melanocytach człowieka (HeM).
Na podstawie wyników naszych badań ekspresję FR w komórkach linii MCF-7/DOX określiliśmy jako słabą i miejscami średnią, co pokrywa się z wynikami Koong-Nah Chung [17].
W pracy O’Shannessy [18] stwierdzono, że o poziomie ekspresji FR w komórkach gruczołu sutkowego decyduje brak ekspresji, występującego także w tych komórkach, receptora estrogenowego (ER), czym tłumaczymy nasze wyniki.
Silną ekspresję FR wykazują komórki linii SKOV 3 oraz SW626, czyli nowotwory jajnika.
Badania wykazują, że w innych liniach komórkowych raka jajnika (m.in. OVCAR-3) także występuje bardzo duża ekspresja, podczas gdy np. w liniach OVCA 420, Dov13 i TOV21G zaobserwowano znacznie mniejszą ilość tego receptora [19]. W porównaniu do linii komórkowych zdrowej tkanki nabłonkowej jajnika, ekspresja FR w komórkach nowotworowych głównie linii SKOV 3 oraz SW626 jest znacznie wyższa [19]. Tak wysoką ekspresję, potwierdzają również badania przeprowadzone na tkankach pobranych od pacjentek w różnym stadium choroby [12,19,20]. Istotne jest, że poziom ekspresji może być związany z stopniem zaawansowania oraz typem nowotworu. Wiele prac wskazuje na to, że w późniejszych fazach jest on najwyższy [9,12,21]. Badania Giuseppe Toffoli [12] wskazują zaś, że FRs występują najliczniej w rakach typu surowiczego, stwierdzanego w 75% przypadków zachorowań [22]. Obecność tak dużej ilości receptorów na powierzchni najczęściej występującego typu nowotworu jajnika sugeruje, że może być to dobry przykład do zastosowania terapii celowanej. Użycie leku (np. doksorubicyny), związanego z cząsteczką kwasu foliowego może okazać się skutecznym sposobem na poprawienie efektywności i zmniejszenie skutków ubocznych chemioterapii [23]. Większą efektywność takiego postępowania potwierdzają badania Xiuli Hu [24], które wykazały, że internalizacja substancji związanej z kwasem foliowym w komórkach linii SKOV 3 jest większa niż w przypadku tej samej substancji bez kwasu.
Dotychczasowe wyniki badań klinicznych prowadzonych przez Georgia Health Sciences University na 149 pacjentkach w 65 ośrodkach na terenie Ameryki Północnej i Polski, wykazują skuteczność terapii celowanej przy użyciu receptora kwasu foliowego do internalizacji leków
170
znakowanych kwasem foliowym, przy czym zauważono, że im większa ekspresja tego receptora, tym lepsze są skutki terapii, co w praktyce potwierdza wyniki i założenia naszych badań [25].
Nie należy zapominać o odmiennej ilości FRs, a także o tym, że sama możliwość przedostania się związku do wnętrza komórki nie gwarantuje efektywności leczenia, czego przykładem może być terapia przy zastosowaniu antyfolianu MTX w leczeniu czerniaka [16].
Cytostatyki po przedostaniu się do wnętrza komórki muszą zainicjować szlaki metaboliczne prowadzące do apoptozy. Wszelkie nieprawidłowości i utrudnienia zarówno w internalizacji leków, jak i w ich działaniu wewnątrz komórek mogą prowadzić do oporności.
W takim przypadku ważne jest prowadzenie badań nad sposobami zwiększenia wrażliwości na terapię.
5. Podsumowanie
Ocena ekspresji FR w komórkach nowotworowych i prawidłowych dostarcza cennych informacji o tym, w których nowotworach stosowanie cytostatyków połączonych z kwasem foliowym może zwiększać efektywność i bezpieczeństwo terapii, a w których należy poszukiwać innych mechanizmów. Sama nadekspresja nie świadczy o skuteczności metody. Potrzebne są więc dalsze badania wykazujące skuteczną internalizację i uruchamianie apoptozy przez leki znakowane kwasem foliowym.
Dziękujemy za opiekę naukową dr hab. Jolancie Saczko oraz dr Julicie Kulbackiej.
Literatura
[1] L. B. Bailey, J. F. Gregory III: Folate Metabolism and Requirements. J. Nutr., 1999; 129(4):
779-782
[2] H. Czeczot: Kwas foliowy w fizjologii i patologii. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2008; 62:
405-419
[3] M. Tuszyńska: Folic acid – The occurance and the role in human nutrition. Vegetable Crops Res. Bulletin, 2012; 76: 43-54
[4] E. Cieślik, A. Kościej: Kwas foliowy – występowanie i znaczenie. Probl Hig Epidemiol, 2012;
93(1): 1-7
[5] J. F. Gregory III: Bioavailability of Nutrients and Other Bioactive Components from Dietary Supplements. J. Nutr., 2001; 131: 1376–1382
[6] S. M. Ametamey et al.: Radiosynthesis and Preclinical Evaluation of 3'-Aza-2'-[18F]Fluorofolic Acid – A Novel PET Radiotracer for Folate Receptor Targeting. Bioconjugate Chemistry, 2012 [7] G. L. Zwicke, G. A. Mansoori, C. J. Jeffery: Utilizing the folate receptor for active targeting of cancer nanotherapeutics. Nano Reviews, 2012; 3: 18496
[8] C. Muller, R. Schibli: Folic Acid Conjugates for Nuclear Imaging of Folate Receptor–Positive Cancer. The Journal of Nuclear Medicine, 2011; 52(1)
[9] S. Markert et al.: Alpha-folate Receptor Expression in Epithelial Ovarian Carcinoma and Non-neoplastic Ovarian Tissue. Anticancer Res., 2008; 28: 3567-3572
[10] D. J. O’Shannessy et al.: Characterization of the Human Folate Receptor Alpha Via Novel Antibody-Based Probes, Oncotarget, 2011; 2:1227 – 1243
[11] J. F. Ross, P. K. Chaudhuri and M. Ratnam: Differential Regulation of Folate Receptor Isoforms in Normal and Malignant Tissues In Vivo and in Established Cell Lines. CANCER, 1994; 73: 2432-2443
[12] G. Toffoli, et al.: Overexpression of Folate Binding Protein in Ovarian Cancers. Int. J. Cancer (Pred. Oncol.), 1997; 74: 193–198
171
[13] V. M. Schoop, N. Mirancea, N. E. Fusenig: Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. The Journal of Investigative Dermatology, 1999; 112: 343-353
[14] L. E. Kelemen: The role of folate receptor a in cancer development, progression and treatment:
Cause, consequence or innocent bystander? Int. J. Cancer, 2006; 119: 243–250
[15] T. Mironava, M. Simon, M. H. Rafailovich, B. Rigas: Platinum folate nanoparticles toxicity:
Cancer vs. normal cells. Toxicology in Vitro, 2013; 27: 882–889
[19] M. K. Siu et al.: Paradoxical impact of two folate receptors, FRα and RFC, in ovarian cancer:
effect on cell proliferation, invasion and clinical outcome. PLoS One, 2012; 7(11): e47201 [20] K. R. Kallia et al.: Folate receptor alpha as a tumor target in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol, 2008; 108(3): 619-26
[23] X. Zha, H. Li, R. J. Lee: Targeted drug delivery via folate receptors. Expert Opin Drug Deliv, 2008; 5(3): 309-319
[24] X. Hu et al.: Biodegradable Block Copolymer-Doxorubicin Conjugates via Different Linkages:
Preparation, Characterization, and In Vitro Evaluation. Biomacromolecules, 2010; 11(8): 2094–
2102
[25] http://www.sciencedaily.com/releases/2011/10/111028115340.htm