Małgorzata Kozłowska1, Mirosława Różycka1
Streszczenie: Białka inherentnie nieuporządkowane (IDPs, ang. Intrinsically Disordered Proteins) stanowią nowoodkrytą i stale rosnącą grupę białek. W odróżnieniu od białek globularnych w warunkach fizjologicznych pozbawione są one stabilnej struktury trzeciorzędowej. Uważa się, że duża plastyczność IDPs pozwala im na wydajne oddziaływanie z wieloma różnymi partnerami. Obecnie białka należące do rodziny IDPs budzą wielkie zainteresowanie badaczy, dlatego też stale rośnie liczba technik mających na celu ich identyfikację oraz charakterystykę.
Słowa kluczowe: białka inherentnie nieuporządkowane, IDPs
1. Wprowadzenie
Przez dziesiątki lat uważano, iż białka (w szczególności enzymy) muszą posiadać jednoznacznie zdefiniowaną i w dużej mierze stabilną trzeciorzędową strukturę, aby móc pełnić specyficzną funkcję. Istnieją dwa modele tłumaczące oddziaływanie enzymu z substratem, „model zamka i klucza” zaproponowany przez Fischera oraz „model wymuszonego dopasowania”
wprowadzony przez Koshlanda, które zdominowały na długi czas sposób zrozumienia zależności występujących pomiędzy strukturą a funkcją. Przez wiele lat badania biochemiczne skupiały się na poznawaniu struktury i funkcji kolejnych białek zgodnie z paradygmatem: sekwencja stabilna struktura trzeciorzędowa określona funkcja [1]. Zgodnie z powyższym białko fałduje przyjmując określoną strukturę zgodnie z informacją zapisaną w jego strukturze pierwszorzędowej i tylko w tej postaci może pełnić swą funkcję biologiczną. Dziś wiadomo, że paradygmat ten nie może być uogólniany na wszystkie białka, a w przypadku braku strukturalnego uporządkowania upatruje się daleko idące korzyści. Białka o inherentnie nieuporządkowanej strukturze (IDPs, ang. intrinsically disordered proteins), to białka nieposiadające uporządkowanej, stabilnej struktury drugo- i trzeciorzędowej w warunkach uznawanych za fizjologiczne, a mimo to mogą pełnić istotne funkcje biologiczne. IDPs szereg swoich funkcji pełnią albo bezpośrednio w stanie nieuporządkowanym, albo po przejściu ze stanu nieuporządkowanego do stanu uporządkowanego, np. na skutek oddziaływania z partnerem [2].
Obecnie zjawisko strukturalnego nieuporządkowania jest coraz bardziej powszechne.
Analizy bioinformatyczne wykazują, że aż 25-30% białek eukariotycznych jest w dużej mierze nieuporządkowanych, ponad połowa z nich zawiera długie nieuporządkowanego regiony, a ok 70%
białek zaangażowanych w szlaki przekazywania sygnałów, wyposażone jest w długie nieuporządkowane fragmenty [3]. Przypuszczalnie wzrost nieuporządkowania u Eucaryota wiąże się ze wzrostem złożoności szlaków sygnałowych w organizmach wielokomórkowych. Nie jest zatem zaskakujący fakt, iż zainteresowanie IDPs jest coraz większe, a w ciągu ostatnich kilkunastu lat odnotowano swoistą eksplozję publikacji poświęconych tej grupie białek.
1 Wydziałowy Zakład Biochemii Politechniki Wrocławskiej, ul. Gdańska 7/9 50-344 Wrocław, malgorzata.kozlowska@pwr.wroc.pl, miroslawa.rozycka@pwr.wroc.pl
95
2. Przewidywanie stanu nieuporządkowania – wykorzystanie narzędzi bioinformatycznych
Obecna wiedza na temat IDPs pozwoliła na określenie ich cech wspólnych odróżniających je od białek globularnych. Okazuje się, że IDPs posiadają odmienny skład aminokwasowy bogaty w reszty niosące niezrównoważony ładunek (najczęściej ujemny) promujące nieuporządkowaną strukturę: A, R, G, Q, S, P, E i K, przy jednocześnie małym udziale reszt o hydrofobowym łańcuchu bocznym promujących strukturę uporządkowaną: W, C, F, I, Y, V, L oraz N (Rys. 1. A) [1]. Dzięki tym obserwacjom możliwe było opracowanie metod do przewidywania braku struktury w sekwencjach nowo poznanych białek.
Występujące w dużej ilości w sekwencjach IDPs kwaśne i zasadowe reszty aminokwasowe wprowadzają duży nieskompensowany ładunek, co przy jednoczesnej małej zawartości reszt hydrofobowych wyraźnie odróżnia IDPs od białek globularnych. Wykres Uversky’ego koreluje oba te parametry, dzięki czemu możliwe było zdefiniowanie wartości granicznych, które pozwalają w prosty sposób zaklasyfikować nowopoznane białka do klasy IDPs lub do grupy białek globularnych (Rys.1. B) [3].
Rys. 1. Cechy charakterystyczne składu aminokwasowego IDPs
A. Analiza składu IDPs wykonana za pomocą programu Composition Profiler. Porównanie składu białek globularnych z bazy PDB S25 (szare słupki) i IDPs z bazy DisProt 3.4 (puste słupki) ze składem aminokwasowym wszystkich białek zdeponowanych w bazie SwissProt51. Wartości ujemne oznaczają niższą zawartość danego aminokwasu w porównaniu
z bazą SwissProt51, natomiast wartości dodatnie wyższą [4].
B. Wykres Uversky’ego. Zestawienie wartości średniej hydrofobowości białek globularnych (szare kółka) oraz IDPs (puste kółka) ze średnimi ładunkami netto tych białek. Białka globularne od IDPs oddziela umowna granica (czarna
linia). Na podstawie [3].
W wyniku tych obserwacji, zaproponowano szereg algorytmów, które na podstawie analizy sekwencji aminokwasowej białek przewidują obecność w nich regionów pozbawionych struktury.
Do najczęściej wykorzystywanych algorytmów należą: PONDR [1], DISOPRED [5] i IUPred [6].
Algorytmy te działają na zasadzie sieci neuronowych, do których wprowadzane są sekwencje aminokwasowe białek, których przynależność do rodziny IDPs potwierdzono doświadczalnie.
Jednak samo przewidywanie komputerowe nie może być dowodem na brak strukturalnego uporządkowania w białku. Takich dowodów dostarczyć mogą jedynie badania eksperymentalne.
A B
2. Charakterystyka stanu nieuporządkowania – techniki eksperymentalne
Ponieważ IDPs charakteryzują się nietypowymi właściwościami strukturalnymi, wymogły one opracowanie metod badawczych ukierunkowanych na ta grupę białek.
2.1. Identyfikacja stanu nieuporządkowanego
Najbardziej bezpośrednią metodą umożliwiającą identyfikację IDPs jest analiza rentgenograficzna, która nie pozwala na bezpośrednie stwierdzenie obecności stanu nieuporządkowanego, ale na brak stanu uporządkowania [1]. Z powodu trudności w otrzymaniu kryształów białek nieuporządkowanych technikę tą stosuje się głównie do określenia struktury IDPs w kompleksie z partnerem, który powoduje przyjmowanie przez IDPs uporządkowanej struktury.
Do popularnych technik badania IDPs należy również spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR, ang. Nuclear Magnetic Resonance), która ogranicza się jednak tylko do badania małych białek, których masa nie przekracza 40 kDa.
Wymienione wyżej techniki wspomagane są przez szereg metod optycznych takich jak fluorymetria, spektroskopia dichroizmu kołowego (CD, ang. Circural Dichroism Spectroscopy) czy spektroskopia fourierowska w podczerwieni (FTIR, ang. Fourier Transform Infra-Red Spectroscopy). Widma fluorescencyjne pozwalają na obserwację aromatycznych chromoforów w białku, dzięki czemu możliwe jest stwierdzenie istnienia bądź braku określonej struktury trzeciorzędowej. Spektroskopia dichroizmu kołowego w dalekim UV umożliwia ilościowe określenie zawartości struktur drugorzędowych w białkach. Wynika to z faktu, iż sygnał CD w paśmie absorpcji wiązania peptydowego zależy od przyjmowanej struktury drugorzędowej białka. IDPs wykazują charakterystyczne maksimum ujemne dla światła o długości fali 200 nm.
Wśród metod eksperymentalnych istnieje jeszcze wiele innych technik, które znalazły szerokie zastosowanie w badaniu IDPs. Określenie parametrów hydrodynamicznych cząsteczki białka możliwe jest dzięki takim technikom jak ultrawirowanie analityczne, sączenie molekularne, dynamiczne rozpraszanie światła (DLS, ang. Dynamic Light Scattering) czy niskokątowe rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego (SAXS, ang. Small Angle Xray Scattering).
Techniki te okazują się być przydatne, gdyż zawyżona wartość promienia hydrodynamicznego jest cechą charakterystyczną IDPs. Ponieważ IDPs wykazują nietypowy skład aminokwasowy, podczas analizy elektroforetycznej w warunkach denaturujących (SDS-PAGE, ang. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) wiążą one mniej SDS niż białka globularne, co w efekcie zmniejsza ich ruchliwość elektroforetyczną. W wyniku tego pozorna masa IDPs wyznaczona w tym eksperymencie jest zawyżona 1,2 – 1,8 razy w stosunku do masy obliczonej na podstawie sekwencji aminokwasowej lub zmierzonej za pomocą spektroskopii mas.
Ponieważ IDPs charakteryzują się rozciągniętą strukturą i wysoką ekspozycją wiązań peptydowych, wykazują one zwiększoną podatność na proteolizę w warunkach in vitro, co również w pośredni sposób wskazuje na brak uporządkowanej struktury w białku.
2.2. Charakterystyka lokalnych zmian konformacyjnych
Informacji o lokalnych zmianach konformacyjnych w wyniku fałdowania lub rozfałdowywania białka, np. w odpowiedzi na obecność partnera białkowego lub innego liganda, dostarczają takie metody jak spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznago (EPR, ang. Electron Paramagnetic Resonance) i rezonansowe przeniesienie energii wzbudzenia elektronowego (FRET, ang. Förster Resonance Energy Transfer). Zastosowanie technik FRET i EPR wymaga wprowadzenia do cząsteczki białka znaczników, odpowiednio fluorescencyjnych i spinowych.
97
3. Podsumowanie
W ostatnich latach zaobserwowano coraz większe zainteresowanie tematyką białek inherentnie nieustrukturyzowanych, co obrazuje wzrost ilości publikacji dotyczących tego zagadnienia. Okazuje się, że niedocenianie dotychczas przez badaczy IDP często zaangażowane są w tak ważne procesy jak ekspresja genów, cykl komórkowy czy proliferacja. Ponadto dysfunkcja IDP może prowadzić do patogenezy groźnych chorób, w tym chorób neurodegeneracyjnych i nowotworowych [7,8]. Identyfikacja IDP stanowi wciąż ogromne wyzwanie dla biochemików, a poznanie mechanizmów ich działania może okazać się niezwykle istotne dla zrozumienia ważnych procesów życiowych.
Literatura
[1] A.K. Dunker, J.D. Lawson, C.J. Brown, i wsp. (2001). Intrinsically disordered protein. J Mol Graph Model 19(1): 26‐59.
[2] V.N. Uversky (2009). Intrinsically disordered proteins and their environment: effects of strong denaturants, temperature, pH, counter ions, membranes, binding partners, osmolytes, and macromolecular crowding. Protein J28:305-325.
[3] V.N. Uversky, J.R. Gillespie i A.L. Fink (2000). Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins 41(3): 415‐427.
[4] V. Vacic, V.N. Uversky, A.K. Dunker i S. Lonardi (2007). Composition Profiler: a tool for discovery and visualization of amino acid composition differences. BMC Bioinformatics 8: 211.
[5] J.J. Ward, L.J. McGuffin, K. Bryson, B.F. Buxton i D.T. Jones (2004). The DISOPRED server for the prediction of protein disorder. Bioinformatics 20(13): 2138‐2139.
[6] Z. Dosztanyi, V. Csizmok, P. Tompa i I. Simon (2005). IUPred: web server for the predistion of intrinsically unstructured regions of proteins based on estimated energy content. Bioinformatics 21 : 3433-3434.
[7] S. Das, D. Mukhopadhyay (2011). Intrinsically unstructured proteins and neurodegenerative diseases: conformational promiscuity at its best. IUBMB Life 63, 478-488.
[8] M. Pajkos, B. Meszaros, I. Simon, Z. Dosztanyi (2012). Is there a biological cost of protein disorder? Analysis of cancer-associated mutations. Mol. Biosyst 8, 296-307.
I
NTRINSICALLY DISORDERED PROTEINSIntrinsically disordered proteins (IDPs) belong to the newly discovered and still growing group of proteins. In contrast to globular proteins members of this family fail to form rigid 3-D structures under physiological conditions, either along entire lengths or only in localized regions.
It is thought that the structural high flexibility and plasticity enable IDPs to adopt different conformations in respond to different proteins or ligands. Many of these intrinsically proteins are known to carry out important biological functions which, in fact, depend on the absence of a specific 3-D structure. The existence of such proteins does not fit the structure-function paradigm, which requires from proteins a stable structure to perform biological functions. Currently, IDPs are the mostly dynamic and rapidly advancing fields in modern protein science. IDPs discovery reveals a new face of proteins and constitutes a new challenge for modern biochemistry.
98