Katarzyna Dzierzba1, Jadwiga Pietkiewicz1, Andrzej Gamian1,2
Streszczenie: Fosforylacja - często występująca w białkach modyfikacja po-translacyjna - to odwracalna reakcja przyłączania reszty fosforanowej do nukleofilowego atomu dowolnego związku chemicznego. Reakcja ta może zachodzić także bez udziału specyficznych enzymów (kinaz), czyli w sposób nieenzymatyczny. W pracy przedstawiono wyniki badań własnych, gdzie wykorzystano białko modelowe jako potencjalny substrat dla wysokoenergetycznego fosforanu, przenoszonego na nośnik białkowy bez udziału enzymów.
Słowa kluczowe: fosforylacja nieenzymatyczna, transfosforylacja, defosforylacja
1. Wprowadzenie
Odwracalna fosforylacja białek jest jednym z najważniejszych mechanizmów regulacyjnych, charakterystycznym zarówno dla organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych [1-4]. Większość tych procesów przebiega przy udziale specyficznych enzymów, zwanych kinazami (fosforylacja) bądź fosfatazami (defosforylacja). Odwracalna fosforylacja i defosforylacja powodują zmiany konformacyjne enzymów i receptorów, skutkiem czego jest ich aktywacja lub dezaktywacja. Reakcje fosforylacji i defosforylacji dotyczą głównie łańcuchów bocznych reszt seryny, tyrozyny i treoniny, ale również histydyny w białkach eukariotycznych. Zaobserwowano, że fosforylacja reszt histydyny w tych białkach występuje znacznie częściej niż w przypadku reszt tyrozynowych [5]. Natomiast w białkach prokariotycznych, reakcje fosforylacji mogą zachodzić nie tylko na grupie hydroksylowej reszt seryny, treoniny, tyrozyny czy pierścienia imidazolowego histydyny, ale również na łańcuchach bocznych reszt argininy bądź lizyny [1].
Fosforylacja przy udziale specyficznych kinaz oraz defosforylacja za pomocą odpowiednich fosfataz to kluczowe reakcje dla przebiegu wielu procesów komórkowych, związanych m.in. z większością reakcji metabolicznych, ale również z procesami wzrostu, proliferacji komórkowej, różnicowania komórek, onkogenezy, czy także zaprogramowanej śmierci komórki (apoptoza) [6]. Warto dodać, że w wyniku kowalencyjnego przyłączania grupy modyfikującej, którą najczęściej jest grupa fosforanowa (PO4
3-), dochodzi zazwyczaj do zmian właściwości katalitycznych wielu enzymów. W tych reakcjach donorem fosforanu mogą być wysokoenergetyczne trifosforany nuklozydów (np. ATP, GTP). W przypadku enzymów odpowiedzialnych za reakcję fosforylacji, czyli kinaz białkowych wiadomo, że jest to jedna z największych znanych rodzin białek, a ich różnorodność sprawia, że enzymy te umożliwiają precyzyjne dostosowanie regulacji przeprowadzanych procesów zarówno do czasu ich zachodzenia, jak i do rodzaju tkanki lub wykorzystywanego substratu [7].
Cechą charakterystyczną reakcji fosforylacji i defosforylacji z udziałem kinaz i fosfataz jest to, że nie stanowią one prostych odwrotności. W warunkach fizjologicznych każda z tych przemian może być reakcją nieodwracalną, a brak odpowiednich enzymów powoduje, że katalizowane przez nie przemiany zachodzą z niewielką wydajnością. Fosforylacja, która pełni rolę skutecznego
1Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław, e-mail: katarzyna.dzierzba@gmail.com
2Laboratorium Mikrobiologii Lekarskiej, Zakład Immunologii Chorób Zakaźnych Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda we Wrocławiu, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław, e-mail:
gamian@iitd.pan.wroc.pl
69
sposobu kontrolowania aktywności białek, przyczynia się nie tylko do modyfikacji oddziaływań elektrostatycznych w białkach (poprzez zrywanie i odtwarzanie określonych oddziaływań elektrostatycznych), ale również do generowania silnie ukierunkowanych wiązań wodorowych.
To pozwala na specyficzne oddziaływania ze związanymi donorami protonów [7]. Ponadto, fosforylacja przyczynia się do wzmacniania sygnału np. hormonalnego, gdyż jedna cząsteczka kinazy może być odpowiedzialna za fosforylację wielu kolejnych białek docelowych [7].
Ciekawym wydaje się być przykład udziału reakcji fosforylacji w metabolizmie glikogenu, formy zapasowej glukozy w organizmie. Proces ten zależy od poziomu regulacji uwalniania i gromadzenia glukozy oraz podlega oddziaływaniom allosterycznym z udziałem metabolitów, sygnalizujących zapotrzebowanie komórki na substraty energetyczne. Ponadto metabolizm glikogenu jest regulowany przez kaskadę reakcji stymulowanych hormonalnie, zależnej także od odwracalnej fosforylacji enzymów, która zmienia ich właściwości kinetyczne [7]. Przykładem może być mięśniowa kinaza fosforylazowa – enzym, który aktywuje fosforylazę b poprzez fosforylację.
Białko to jest tetramerem i składa się z czterech podjednostek (αβγδ). Aktywność katalityczna białka znajduje się w podjednostce γ, podczas gdy inne podjednostki pełnią jedynie funkcje regulatorowe. Dodatkowo, podjednostka δ strukturalnie przypomina kalmodulinę i odpowiada za wiązanie jonów Ca2+ [7]. Białko to podlega kontroli na drodze fosforylacji oraz na skutek wzrostu stężenia jonów Ca2+. Tak więc zarówno substrat kinazy fosforylazowej, czyli fosforylaza, jak i samo białko jest regulowane na drodze fosforylacji. Dzięki tej modyfikacji, kinaza przekształcana jest z formy o małej aktywności w formę bardzo aktywną wskutek fosforylacji dwóch reszt seryny w podjednostce β. Proces ten stanowi jeden z etapów ważnej kaskady transdukcji sygnałów w komórce, a jego regulacja jest uzależniona ponadto od obecności specyficznych hormonów [7].
W przypadku mechanizmów fosforylacji przebiegającej bez udziału enzymów, na drodze nieenzymatycznej modyfikacji, w literaturze opisanych zostało jedynie kilka przykładów takich przemian. Dotychczasowa wiedza pozwoliła na ustalenie, że w komórkach istnieją wysokoenergetyczne cząsteczki, zwane pirofosforylowanymi polifosforanami inozytolu (PP-IPs), które mogą oddawać białkom grupy fosforanowe w nieenzymatycznej i zależnej od temperatury reakcji. Specjalnie zaprojektowana seria eksperymentów pokazała, iż pirofosforany inozytolu są fizjologicznymi donorami fosforanu dla wybranych białek eukariotycznych, lokalizowanych w jąderkach, które odpowiedzialne są za procesy biogenezy rybosomów [8-9]. W badaniach tych dowiedziono również, że pirofosforan inozytolu (IP7) – przedstawiciel rodziny pirofosforylowanych polifosforanów inozytolu – stanowi fizjologiczny donor grupy fosforanowej. Dzięki niemu możliwa jest fosforylacja przebiegająca bez udziału odpowiednich kinaz białkowych, czyli w sposób nieenzymatyczny [8-9].
Do tej pory sądzono, że pirofosforylowane polifosforany inozytolu (PP-IPs), będące wtórnymi przekaźnikami, biorą udział tylko w dwóch sposobach przekazywania sygnału. Z jednej strony, rozpuszczalne w wodzie polifosforany inozytolu wykorzystują klasyczny szlak komórkowy, polegający na przejściowym wiązaniu się tych cząsteczek do substratu i następującej w wyniku tej reakcji zmiany konformacyjnej efektora. Przykładem tego sposobu przekazywania sygnału może być wiązanie 1,4,5-trisfosforanu inozytolu (IP3) do tetramerycznego receptora kanału wapniowego i allosteryczne bramkowanie procesu uwalniania jonów Ca2+ [9]. Drugi sposób transdukcji sygnału odbywa się poprzez błonę komórkową, zawierającą fosforany inozytolu związane z rdzeniem glicerolofosfolipidu. Synteza w błonie komórkowej tych pochodnych - lipidów inozytolu, powoduje rekrutację białek sygnalizacyjnych np. kinaz serynowo-treoninowych (kinazy Akt).
Poprzez zlokalizowane w nich domeny wiążące, możliwe jest przekształcenie 3’-fosfoinozytoli do 3,4,5-trifosforanu fosfatydyloinozytolu (PIP3) [9]. Odkrycie, że polifosforany inozytolu zawierają labilne grupy pirofosforanowe, zasugerowało, iż mogą one uczestniczyć w nowych mechanizmach wewnątrzkomórkowej sygnalizacji. Z kolei trzeci sposób przekazywania informacji w komórce, polega na bezpośrednim przekazaniu grupy β-fosforanowej na reszty seryny lub treoniny
70
docelowego białka [9]. W tym przypadku dowiedziono, że fosforylacja zachodząca w sposób nieenzymatyczny z udziałem jedynie cząsteczek IP7, przy całkowitym braku kinaz, jest możliwa termodynamicznie [9].
W celu wykazania możliwości zachodzenia procesu fosforylacji bez udziału enzymów, czyli w sposób nieenzymatyczny posługiwano się odpowiednim białkiem modelowym tj. preparatem handlowym proteinazy K, stanowiącym swoistą matrycę do badania tego procesu oraz bakteryjnym lipopolisacharydem ekstrahowanym ze szczepu Escherichia coli, stanowiącym potencjalne źródło wysokoenergetycznego fosforanu, zdolnego do fosforylowania grup hydroksylowych w resztach serynynowych (Ser), treoninowych (Thr) i tyrozynowych (Tyr) obecnych w badanym białku.
Dobór białkowej matrycy modelowej do eksperymentu nieenzymatycznej fosforylacji prowadzono w oparciu o dane dotyczące zawartości reszt aminokwasowych (zwłaszcza Ser, Thr i Tyr) w różnych białkach oraz możliwości ich modyfikacji na drodze fosforylacji. Spośród wielu dostępnych białek wybrano proteinazę K, ponieważ składa się ona z 384 reszt aminokwasowych i zawiera aż 44 reszt Ser (11,5%), 24 reszt Thr (6,2%) i 20 reszt Tyr (5,2%), interesujących ze względu na możliwość przyłączenia grupy fosforanowej do atomu tlenu grupy hydroksylowej w aminokwasie.
W planowaniu badań wykorzystywano również dostępne aplikacje komputerowe, pozwalające nie tylko na przewidywanie potencjalnych miejsc fosforylacji w białkach eukariotycznych (aplikacja NetPhosp 2.0) [10], ale także programy służące do określania przestrzennej lokalizacji określonych reszt aminokwasowych w białku, zdolnych do tworzenia charakterystycznych epitopów, które mogą oddziaływać np. ze specyficznymi przeciwciałami (m.in.. aplikacje komputerowe BEpro Discontinuous B-Cell Epitope Prediction (PEPITO) [11], DiscoTope 2.0 [12], czy BepiPred 1.0 [12]). Wyniki tych przewidywań teoretycznych są istotne, gdyż pozwoliły na bezpośrednie wytypowanie reszt aminokwasowych w białku podatnych na reakcję fosforylacji poprzez ustalenie, czy interesujące reszty lokalizowane są na powierzchni białka i czy są odpowiednio eksponowane do otaczająco mikrośrodowiska. Badania teoretyczne pozwoliły zaplanować także praktyczne eksperymenty, ponieważ dzięki nim dokonano ilościowego szacowania stosowanych reagentów, co mogło wpływać również na wydajność prowadzonych eksperymentów.
2. Materiał i metody
W badaniach wykorzystywano białko modelowe tj. preparat handlowy proteinazy K (DNA Gdańsk, Polska), otrzymanej z Tritirachium album. W pracy opisano przygotowanie matrycy białkowej do eksperymentu fosforylacji nieenzymatycznej. W tym celu wybrane białko poddawano najpierw reakcji defosforylacji przeprowadzonej w sposób chemiczny z zastosowaniem czynnika defosforylującego tj. 25% (v/v) kwasu fluorowodorowego (HF) [6]. Dla badanego białka przygotowano cztery kolejne próby oznaczone jako KO, WO, W1 i W2. Próbki kontrolne białka, które nie poddawano defosforylacji chemicznej oznaczano jako KO (białko natywne). Próbki białka poddawane defosforylacji chemicznej z udziałem HF oznaczano jako WO (jako dodatkowa kontrola procesu fosforylacji zachodzącej w białku natywnym). Próby WO, KO, W1 i W2 zawierały po 100 µg białka. Reakcję defosforylacji prowadzono w obecności 20% (v/v) HF, przy stężeniu białka wynoszącym 0,5 mg/ml odpowiednio w próbach KO, WO, W1 i W2. Próby W1 i W2 zostały zachowane i przeznaczone do dalszych eksperymentów z udziałem wysokoenergetycznego fosforanu. Defosforylację białek w odpowiednich próbach prowadzono w temperaturze 30°C przez 3 dni. Kolejno próbki zdefosforylowane KO i W2 zliofilizowano do sucha w celu usunięcia lotnych pozostałości roztworu zawierającego HF. Próby nie poddawane defosforylacji (KO i W1) przygotowano w analogiczny sposób, z tym że zamiast HF do prób reakcyjnych dodawano wodę MiliQ.
71
3. Wyniki
Immunochemiczną detekcję połączeń fosfoserynowych/fosfotreoninowych/fosfo tyrozynowych na wybranej matrycy białkowej tj. proteinazie K przy pomocy specyficznych przeciwciał anty–P-Ser/ P-Thr/P-Tyr (Pierce, Thermo Scientific) wykonano metodą ELISA. Jako antygeny zastosowano dwa warianty badanego białka, oznaczone odpowiednio jako KO (próbki kontrolne białka nie poddawanego defosforylacji chemicznej) oraz WO (próbki białka poddawane defosforylacji chemicznej za pomocą HF, stanowiące dodatkową kontrolę procesu defosforylacji zachodzącej w białku natywnym). Zastosowano przeciwciała wychwytujące w rozcieńczeniach 2*103, 2*105 i 1*103 oraz przeciwciała detekcyjne w rozcieńczeniu 3*103.
Istotą przeprowadzonych eksperymentów stało się również określenie, czy względny stosunek immunoreaktywności dla prób WO i KO spełnia zależność WO/KO < 100% , co oznacza, że HF stosowany jako czynnik defosforylujący powoduje skuteczną defosforylację matrycy białkowej (Tab.1). Skuteczność defosforylacji ustalono za pomocą wyrażenia (100% - WO/KO).
Tab. 1. Immunoreaktywność prób KO i WO proteinazy K w teście ELISA z zastosowaniem przeciwciał wychwytujących anty–P-Ser/ P-Thr/P-Tyr rozpoznających połączenia fosfoserynowe/ fosfotreoninowe/
fosfotyrozynowe w białkach.
W literaturze naukowej procesy fosforylacji zachodzącej bez udziału enzymów są słabo opisane. Autorzy skupiają się głównie na poznawaniu procesów enzymatycznej fosforylacji zachodzącej przy pomocy specyficznych kinaz - enzymów należących do grupy transferaz.
Fosforylacja jest procesem przenoszenia reszty fosforanowej do nukleofilowego atomu dowolnego związku chemicznego. Najczęściej fosforylacja przeprowadzana jest na atomie tlenu grupy hydroksylowej lub atomie azotu grupy aminowej. Reszty fosforanowe są przenoszone w sposób enzymatyczny na różne akceptory, wśród których można wyróżnić białka, nukleozydy i nukleotydy, cukry, czy także lipidy. Fosforylacja prowadzi zwykle do zmiany konformacji cząsteczki białka, co pociąga za sobą zmiany jego aktywności katalitycznej, czy ogranicza jego zdolność do wiązania się z specyficznymi substratami bądź innymi białkami. Wiadomo, że do 30% białek podlega regulacji na drodze fosforylacji [6], a większość szlaków metabolicznych i ścieżek sygnalizacyjnych angażuje właśnie enzymy z grupy kinaz białkowych. Białka te pełnią także wiele funkcji regulatorowych, w których pośredniczą również fosfatazy białkowe, odpowiedzialne za reakcje defosforylacji. Doniesienia dotyczące istnienia wysokoenergetycznych cząsteczek, zwanych pirofosforylowanymi polifosforanami inozytolu (PP-IPs), które zdolne są do przekazywania białkom grup fosforanowych na drodze nieenzymatycznej i zależnej od temperatury reakcji powoduje przypuszczenie, że mogą istnieć inne ważne biologicznie cząsteczki o podobnych właściwościach. Podobnie jak pirofosforany inozytolu, mogą one być fizjologicznymi donorami fosforanu dla różnorodnych białek eukariotycznych, ważnych z punktu widzenia prawidłowego funkcjonowania procesów komórkowych w organizmie.
Warto zwrócić uwagę także na fakt, że w prowadzonych badaniach mających na celu opracowanie eksperymentu fosforylacji przebiegającej bez udziału enzymów, w sposób bardzo powierzchowny traktowano dotąd dobór matrycy białkowej do eksperymentu. Problem ten jest na
72
tyle istotny, gdyż białko stanowiące matrycę w prowadzonych badaniach powinno posiadać możliwe jak najwięcej reszt aminokwasowych, na których może zachodzić reakcja odwracalnej fosforylacji. Kluczowa jest tu więc obecność reszt Ser, Thr i Tyr, które ponadto powinny być odpowiednio eksponowane do otaczającego mikrośrodowiska. Odpowiednia lokalizacja tych reszt w białku może zwiększać prawdopodobieństwo zajścia badanej modyfikacji. Po drugie należy pamiętać, że białka stosowane w eksperymentach jako matryce są zwykle ekstrahowane z materiału biologicznego i niektóre modyfikacje mogą występować w nich całkiem naturalnie (np. fosforylacja w białkach natywnych pochodzenia endogennego, czy inne modyfikacje jak np. przyłączone cząsteczki cukrów do białek). Dlatego w przeprowadzonych eksperymentach zastosowano dodatkową modyfikację białka matrycowego, polegającą na przeprowadzeniu jego wcześniejszej defosforylacji. Dobór czynnika defosforylującego okazał się również trudny, gdyż w zasadzie nie istnieją na ten temat żadne doniesienia naukowe. W przeprowadzonych badaniach zastosowano kwas fluorowodorowy (HF) jako czynnik defosforylujący. Tylko w jednej publikacji opisano wydajną metodę przeprowadzania reakcji defosforylacji przebiegającej z udziałem tego kwasu [6].
Warto dodać, że w tych eksperymentach, badacze zamiast białek wykorzystywali krótkie peptydy, bogate w reszty Ser, Thr i Tyr, które po reakcji defosforylacji poddawali analizie przy pomocy metod spektroskopii masowej [6]. Wybrana metoda defosforylacji zapewne nie jest doskonała, ponieważ zamiast krótkich i zdefiniowanych peptydów stosowano białko mające aż 384 aminokwasów, w którym badane reszty Ser, Thr i Tyr stanowią jedynie ok. 23% wszystkich aminokwasów. Dodatkowo przeprowadzone badania teoretyczne z zastosowaniem aplikacji komputerowych wspomagających mapowanie epitopów o charakterze liniowym, jak i nieliniowym, które mogą oddziaływać np. z przeciwciałami, pokazały, że nie wszystkie interesujące reszty aminokwasowe są eksponowane na zewnątrz cząsteczki badanego białka, co może także przekładać się ostatecznie na wydajność prowadzonych modyfikacji. Opisane ograniczenia zostały jednak uwzględnione przy projektowaniu eksperymentu, dlatego można twierdzić, że otrzymane dotychczas wyniki badań stanowią wstęp do prowadzenia dalszych analiz, w tym zastosowania metod spektroskopii mas do identyfikacji różnic masowych w przygotowanych wariantach prób, w których pod uwagę będzie brany nie tylko wpływ endogennej reakcji fosforylacji, ale także sposób przygotowania zdefosforylowanych nośników białkowych w celu uniknięcia tła reakcji, istotnego dla prowadzonych dalszych modyfikacji z udziałem potencjalnego czynnika fosforylujacego.
4. Wnioski
Badanie procesu fosforylacji przebiegającego na nośniku białkowym w sposób nieenzymatyczny z udziałem wysokoenergetycznego fosforanu jest trudne i wymaga nie tylko przeprowadzenia przewidywań teoretycznych dotyczących możliwości modyfikacji badanych białek, ale również zaprojektowania odpowiednich warunków dla prowadzonych reakcji.
Niezbędne jest również opracowanie metod identyfikujących prowadzone modyfikacje.
Immunochemiczna detekcja grup fosfo-Ser/ fosfo-Thr i fosfo-Tyr jest możliwa przy pomocy specyficznych przeciwciał, w prostym i bezpośrednim teście immunoenzymatycznym (ELISA).
Do eksperymentu zostały przygotowane dwa warianty badanego nośnika białkowego.
Uwzględniono fakt, że wybrane białko w sposób endogenny mogło posiadać już zmodyfikowane reszty Ser, Thr i Tyr. Badane próby poddawano najpierw reakcji defosforylacji z użyciem kwasu fluorowodorowego (HF). Poziom defosforylacji określony za pomocą wyrażenia (100% - WO/KO) oszacowano na ok. 24%. Przy planowaniu tego eksperymentu skupiono się na odpowiednim doborze białek jako matryc do badania procesu fosforylacji nieenzymatycznej, ale także poszukiwano skutecznych czynników defosforylujących. Ponadto istotne było także sprawdzanie warunków prowadzonych eksperymentów czy w końcu dobór metod identyfikacji pożądanych
73
modyfikacji, wśród których zaproponowano metody oparte na detekcji komercyjnie dostępnymi przeciwciałami (np. testy ELISA, Western-blotting), ale również metody oparte na spektroskopii masowej czy związane ze stosowaniem izotopów w badaniach biologicznych.
Literatura
[1] AJ. Cozzone: Protein phosphorylation in prokaryotes. Annu. Rev. Microbiol., 1988, 42: 97-125.
[2] JB. Stock, AJ. Ninfa, AM. Stock: Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria. Microbiol. Rev., 1989, 53: 450-90.
[3] C. Chang, RC. Stewart: The two-component system. Regulation of diverse signaling pathways in prokaryotes and eukaryotes. Plant Physiol., 1998, 117: 723-731.
[4] D. Barford, AK. Das, MP. Egloff: The structure and mechanism of protein phosphatases: insights into catalysis and regulation. Annu Rev Biophys Biomol Struct., 1998, 27: 133-164.
[5] J. Ciesla, T. Fraczyk, W. Rode: Phosphorylation of basic amino acid residues in proteins: important but easily missed. Acta Biochim Pol., 2011, 58: 137-147.
[6] H. Kuyama, C. Toda, M. Watanabe, K. Tanaka, O. Nishimura: An efficient chemical method for dephosphorylation of phosphopeptides. Rapid Commun Mass Spectrom., 2003, 17:1493-1496.
[7] JM. Berg, JL. Tymoczko, L. Stryer: Biochemia, 2009, 21: 592-616.
[8] A. Saiardi, R. Bhandari, AC. Resnick, AM. Snowman, SH. Snyder: Phosphorylation of proteins by inositol pyrophosphates. Science, 2004, 306: 2101-2105.
[9] JT. York, T. Hunter: Unexpected mediators of protein phosphorylation. Science, 2004, 306: 2053-2055.
[10] N. Blom, S. Gammeltoft, S. Brunak: Sequence- and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites. Journal of Molecular Biology, 1999, 294: 1351-1362.
[11] MJ. Sweredoski, P. Baldi P: PEPITO: improved discontinuous B-cell epitope prediction using multiple distance thresholds and half sphere exposure. Bioinformatics, 2008, 24: 1459-1460.
[12] JEP. Larsen, O. Lund, M. Nielsen: Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Research, 2006, 2:1-7.
Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.