Metodyka badań

2.1. Otrzymywanie masy komórkowej

Szczep Klebsiella pneumoniae uzyskano z kolekcji mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (nr PCM 2713).

Bakterie hodowano na podłożu BHI w hodowli 18 h całonocnej w temp. 37°C.

134

2.2. Izolacja OMPs metodą wg Witkowskiej i wsp. [31] z własnymi modyfikacjami

Masę bakteryjną przemywano 10 mM buforem Tris-HCl o pH 7,8 z 1 mM MgSO4, 1% glicerolem, 0,5 mM β-merkaptoetanolem. Następnie zawieszano ją w tym samym buforze zawierającym inhibitory proteaz (Millipore). Komórki bakteryjne rozbijano za pomocą dezintegratora ultradźwiękowego przez 25 min Vibra-Cell YC-130PB (Labo-Plus) w temp. 0°C, w cyklach jednominutowych. W celu usunięcia nierozbitych komórek, zawiesinę wirowano 4000 g, przez 20 min w temp. 4°C. Otrzymany supernatant wirowano 100 tys. g przez 1 godz. otrzymując supernatant (cytosol) oraz osad (błony komórkowe). Frakcję błonową (fragmenty błon zewnętrznych i cytoplazmatycznych) przemywano dwukrotnie 10 mM Tris-HCl pH 7,2 z 1 mM MgSO₄, 1% glicerolem, 1 mM β-merkaptoetanolem i 2 % Tritonem X-100 (30 min w temp. 25°C), po czym zawiesinę wirowano przy 100 tys. g, 1 godz. Z zebranego na tym etapie osadu wymywano białka błonowe poprzez dwukrotną ekstrakcję tym samym buforem, zawierającym dodatkowo 5 mM EDTA. Zawiesinę wirowano przy 100 tys. g przez 1 godz., a uzyskany klarowny supernatant, zawierający mieszaninę białek błonowych, dializowano do wody dejonizowanej w celu usunięcia detergentu.

2.3. Izolacja OMPs metodą wg Murphy i Bartos z modyfikacjami Bugli-Płoskońskiej i wsp. [32]

Bakterie namnożone w 50 ml całonocnej hodowli wirowano 2200 g, przez 15 min. Osad zawieszano w mieszaninie buforu (1 M octan sodu i 0,001 M β-merkaptoetanol) i 5% Zwittergentu Z 3-14^® zawierającym 0,5 M CaCl2. Po 1 godz. inkubacji na mieszadle magnetycznym w temp.

pokojowej do zawiesiny dodawano zimny 96% etanol. W celu usunięcia wytrąconych kwasów nukleinowych zawiesinę wirowano (20 min, 12,3 tys. g, temp. 4°C). Do supernatantu ponownie dodano kroplami bardzo wolno zmrożony 96% etanol i wirowano 20 min, 12,3 tys. g, temp. 4°C.

Uzyskany osad suszono przez 1 godz. w temp. pokojowej, a następnie zawieszano w buforze 50 mM Trizma-Base (Sigma) o pH 8,0 zawierającym 0,05% Zwittergent Z 3-14^® i pozostawiano na 1 godz. w temp. pokojowej. Inkubację kontynuowano w temp. 4°C przez całą noc. Następnie zawiesinę wirowano (10 min, 8,7 tys. g, temp. 4°C). Otrzymany supernatant zawierający białka błony zewnętrznej przechowywano w temp. -70°C.

2.4. Elektroforeza denaturująca SDS-PAGE

Stężenie białka w próbie oznaczono komercyjnym zestawem do oznaczania stężenia białek -Pierce^® BCA Protein Assay Kit (Thermo). Elektroforezę denaturującą prowadzono wg Laemmli [33] w żelu poliakrylamidowym w układzie nieciągłym żelu 10% rozdzielającego i 4,5% żelu zagęszczającego w 0,1% SDS, używając aparatu do elektroforezy (Mini Protean, BioRad). Rozdział prowadzono przez 45 min przy napięciu 200 V. Rozdzielone w żelu białka barwiono 0,025% Coomassie Brillant Blue R-250 w 25% metanolu i 10% lodowym kwasie octowym przez 30 min. W celu uwidocznienia prążków białkowych żel odbarwiano w mieszaninie 7,5% kwasu octowego i 5% metanolu. Otrzymane rozdziały dokumentowano i analizowano przy użyciu Molecular Imager GelDoc^TM XR+ (BioRad) w programie Image Lab 3.0 (BioRad).

3. Wyniki i dyskusja

Rozdział elektroforetyczny białek OMP z wykorzystaniem metody SDS-PAGE wykazał znaczne zróżnicowanie profilu białkowego w zależności od zastosowane metodyki izolacji i użytego detergentu. Uwidoczniono białka w zakresie 17-245 kDa. Profil rozdziału OMP po izolacji białek z zastosowaniem TRITON X-100 pozwolił na uwidocznienie 17 prążków białkowych. Większość uwidocznionych białek zawiera się w przedziale 26-51 kDa

135

oraz 76-145 kDa. Zastosowanie Zwittergentu Z 3-14® do ekstrakcji białek błonowych umożliwiło wykazanie 25 prążków, najwięcej w przedziale 29-55 kDa.

Rys.1. Elektroforegram rozdziału białek OMP z komórek K. pneumoniae; ścieżka 1: markery mas cząsteczkowych (Bio-Rad) w kDa, 10 µg, ścieżka 2: OMP izolowane z zastosowaniem detergentu TRITON X-100, 15 µg,

ścieżka 3: OMP izolowane z zastosowaniem detergentu Zwittergent Z 3-14®, 15 µg.

Izolacja białek błony zewnętrznej bez zmiany ich aktywności biologicznej i struktury jest niełatwym zadaniem. Wynika to z konieczności zapewnienia warunków zbliżonych do fizjologicznych, na każdym z etapów izolacji i przechowywania białek. Istotne jest staranne dobieranie metod niedegradujących struktury cząsteczki białka. Jednocześnie użyta metoda musi być specyficzna i minimalizować straty ilościowe białek.

4. Podsumowanie

Pałeczki Klebsiella spp. należą do jednych z najważniejszych i najczęstszych patogenów odpowiedzialnych za infekcje na oddziałach szpitalnych. Wzrost zakażeń pałeczkami Klebsiella spp. spowodowany jest rosnącą opornością tych bakterii na antybiotyki [10]. Bakterie te posiadają wiele czynników wirulencji, m.in. OMPs, biorących udział w zakażeniu, kolonizacji, unikaniu mechanizmów odpowiedzi immunologicznej oraz oporności na antybiotyki. Dokładne poznanie struktury i właściwości białek błony zewnętrznej mogłoby wpłynąć na poprawę skuteczności leczenia zakażeń z udziałem pałeczek Klebsiella spp. Poszukiwanie efektywnych metod izolacji OMPs oraz poszerzanie wiedzy na temat funkcjonalnych właściwości tych białek pozwoliłoby na stworzenie nowych antygenów do produkcji szczepionek przeciwbakteryjnych.

136

Literatura

[1] CT. Fang, SY. Lai, WC. Yi, PR. Hsueh, KL. Liu, SC. Chang. Klebsiella pneumoniae genotype K1: an emerging pathogen that causes septic ocular or central nervous system complications from pyogenic liver abscess. Clin. Infect. Dis. 45(3): 284-93. 2007.

[2] RM. da Silva, J. Traebert, D. Galato. Klebsiella pneumonia carbapenemase (KPC)-producing Klebsiella pneumoniae: a review of epidemiological and clinical aspects.Expert. Opin. Biol.

Ther. 12(6): 663-71. 2012.

[3] TA. Ahmad, LH. El-Sayed, M. Haroun, AA. Hussein, SH. Ashry. Development of immunization trials against Klebsiella pneumoniae. Vaccine. 30(14): 2411-20.2012.

[4] EJ. McGrath, BI. Asmar. Nosocomial infections and multidrug-resistant bacterial organisms in the pediatric intensive care unit. Indian J.Pediatr. 78(2):176-84. 2011.

[5] LK. Siu, KM. Yeh, JC. Lin, CP. Fung, FY. Chang. Klebsiella pneumoniae liver abscess:

a new invasive syndrome. Lancet Infect. Dis. 12(11):881-7. 2012

[6] J. Vallis, C. Leōn, F. Alvarez. Nosocomial bacteremia in critically ill patients: a multicenter study evaluating epidemiology and prognosis. Clin. Infect. Dis. 24, 387- 95. 1997.

[7] P.R. Murray i in. Enterobacteriaceae: Introduction and identification. Manual of clinical microbiology, 8th edition, ASM Press, Washington, D.C: 636-53. 2003.

[8] R. Gaynes, J.R. Edwards. and the National Nosocomial Infections Surveillance System:

Overview of nosocomial infections caused by Gram-negative bacilli. Clin. Infect. Dis.

41: 848-54. 2005.

[9] M. Denton. Enterobacteriaceae. Int. J. Antimicrob. Agents. 3: 9-22. 2007.

[10] A. Sękowska. Wybrane właściwości fizyko-chemiczne pałeczek rodzaju Klebsiella.

Rozprawa doktorska. Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Collegium Medicum w Bydgoszczy. Bydgoszcz, 2005.

[11] S. Bratu, D. Landman, A. George, J. Salvani, J. Quale. J. Winokur. Correlation of the expression of acrB and the regulatory genes marA, soxS and ramA with antimicrobial resistance in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae endemic to New York City.

Antimicrob. Chemother. 64(2):278-83. 2009.

[12] N. Gupta, BM. Limbago, JB. Patel, AJ. Kallen. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae:

epidemiology and prevention. Clin. Infect. Dis. 53(1):60-7. 2011.

[13] AM. Queenan, K. Bush. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases. Clin. Microbiol. Rev.

20(3): 440-58. 2007.

[14] B. Crowley, VJ. Benedí, A. Doménech-Sánchez. Expression of SHV-2 beta-lactamase and of reduced amounts of OmpK36 porin in Klebsiella pneumoniae results in increased resistance to cephalosporins and carbapenems. Antimicrob. Agents Chemother. 46(11): 3679-82. 2002.

[15] E. Padilla, D. Alonso, A. Doménech-Sánchez, C. Gomez, JL. Pérez, S. Albertí, N. Borrell.

Effect of porins and plasmid-mediated AmpC beta-lactamases on the efficacy of beta-lactams in rat pneumonia caused by Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 50(6):

2258-60. 2006.

[16] R. Koebnik, K.P. Locher van Gelder. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels and nutshell. Mol. Microbiol. 37: 239–253. 2000.

[17] V. Koronakis, A. Sharff, E. Koronakis, B. Luisi, C. Hughes. Crystal structure of bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux and protein export. Nature. 405: 914-919.

2000.

[20] A. Chalifour, P. Jeannin, JF. Gauchat, A. Blaecke, M. Malissard, T. N'Guyen, N. Thieblemont, Y. Delneste. Direct bacterial protein PAMP recognition by human NK cells involves TLRs and triggers alpha-defensin production. Blood. 104(6): 1778-83. 2004.

[21] M. Pichavant, Y. Delneste, P. Jeannin, C. Fourneau, A. Brichet, A. Tonnel, P. Gosset. Outer membrane protein A from Klebsiella pneumoniae activates bronchial epithelial cells.

implication in neutrophil recruitment. Immunol. 171(12): 6697-6705. 2003.

[22] C. March, D. Moranta, V. Regueiro, E. Llobet, A. Tomás, J. Garmendia, JA. Bengoechea.

Klebsiella pneumoniae outer membrane protein A is required to prevent the activation of airway epithelial cells. Biol. Chem. 286(12): 9956-9967. 2011.

[23] M. Enrique, P. Manzanares, M. Yuste, M. Martínez, S. Vallés, JF. Marcos. Selectivity and antimicrobial action of bovine lactoferrin derived peptides against wine lactic acid bacteria.

Food Microbiol. 26(3): 340-6. 2009.

[24] T. Ichimura, N. Ikuta, Y. Uda, T. Horigome, S. Omata: Separation of membrane proteins solubilized with a non-denaturing detergent and a high salt concentration by hydroxyapatite high-performance liquid chromatography. Anal. Bioch. 224: 250-255. 1995.

[25] L.R. Eriks, J.A. Mayor. A strategy for identification and quantification of detergents frequently used in the purification of membrane proteins. Anal. Bioch. 323: 234-241. 2003.

[26] J.U Bowie. Stabilizing membrane proteins. Curr. Opin. Struc. Biol. 11: 397-402. 2001.

[27] P.J. Loll. Membrane protein structural biology: the high trough put challenge. J. Struc. Biol.

142: 144-153. 2003.

[28] M.E. Lienqueo, A. Mahn, L. Vasquez, J.A. Asenjo. Methodology for predicting the separation of proteins by hydrophobic interaction chromatography and its application to a cell extract.

J. Chrom. A. 1009: 189-196. 2003. enolase - like protein. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 45: 53-62. 2005

[32] G. Bugla-Płoskońska, B. Futoma-Kołoch, A. Skwara, W. Doroszkiewicz. Use of zwitterionic type of detergent in isolation of Escherichia coli O56 outer membrane proteins improves their two-dimensional electrophoresis (2-DE). Pol. J. Microbiol. 58(3):205-9. 2009.

[33] K. Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685. 1970.

ISOLATION OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE OUTER MEMBRANE PROTEINS