Zakład Medycyny Sądowej Pomorskiej Akademii Medycznej al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin Kierownik: dr hab. n. med. Mirosław Parafiniuk
Summary
Introduction: Amphetamine and its analogues belong to the large group of psychoactive compounds. Due to the growing problem of amphetamine poisoning, author decided to review and improve the laboratory diagnostic procedures with regard to forensic toxicology analysis.
Material and methods: Biological material of 8 persons taken during autopsy for routine toxicological tests was used to examine characteristic of biological matrix. Follow-ing excludion the presence of xenobiotics durFollow-ing expertise process, material was divided and kept in sealed containers, then analysed after defined time period: 0, 30 and 90 days.
Blood, urine, liver, brain and kidney were considered, 96 samples were examined in total.
Biological material was analysed using gas chromatog-raphy equipped with flame ionization detector (GC-FID), liquid chromatography with diode array detector (HPLC- -DAD), and magnetic resonance spectrometer (H NMR).
Conclusions: 1. Workout analytical GC-FID method enable to verify positive initial result of amphetamine and metamphetamine analysis in urine. 2. Biological matrix is composed mainly of low molecular aliphatic organical compounds which cause significant impact in analytical and opinion problem in amphetamine analysis. Its influence determine in proportion as time of biological material self-decomposition and noted cross-reactivity concern both
im-munological and chromatographic methods (HPLC-DAD).
3. H NMR method may be used to confirm amphetamine presence in biological material for confirmation of posi-tive results obtained using immunological and enzymatic methods used in forensic toxicology.
K e y w o r d s: amphetamines – forensic toxicology – biological matrix – NMR.
Streszczenie
Wstęp: Amfetamina oraz jej analogi należą do licznej grupy związków o działaniu psychoaktywnym. Ze względu na rosnącą problematykę zatruć tymi związkami podjęto próbę wyznaczenia nowych diagnostycznych procedur laboratoryjnych w toksykologicznej analizie sądowej am-fetamin.
Materiał i metody: W badaniach nad charakterem tła biologicznego wykorzystano materiał biologiczny ośmiu osób, pobrany w czasie sekcji zwłok w celu przeprowadze-nia rutynowych badań toksykologicznych. Po wykluczeniu obecności ksenobiotyków w procesie eksperckim, materiał dzielono i zabezpieczano w szczelnych pojemnikach, następ-nie analizowano po określonym okresie przechowywania: 0, 30 i 90 dni. Badanym materiałem były: krew, mocz, wątroba, mózg, nerka. Przebadano łącznie 96 próbek.
* Zwięzła wersja rozprawy doktorskiej przyjętej przez Radę Wydziału Lekarskiego Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie. Promotor:
dr hab. n. med. Krzysztof Borowiak. Oryginalny maszynopis obejmuje: 103 strony, 35 rycin, 16 tabel, 113 pozycji piśmiennictwa.
* Concise version of doctoral thesis approved by the Council of the Faculty of Medicine, Pomeranian Medical University in Szczecin. Promotor:
Krzysztof Borowiak M.D., D.M.Sc. Habil. Orginal typescript comprises: 103 pages, 35 figures, 16 tables, 113 references.
48 TOMASZ JANUS Materiał biologiczny analizowano z użyciem
chromato-grafu gazowego z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) oraz za pomocą spektrometru magnetycznego rezo-nansu jądrowego (NMR).
Wnioski: 1. Opracowana metoda analityczna techniką GC-FID pozwala na weryfikację dodatnich wyników analizy wstępnej na obecność amfetaminy oraz metamfetaminy w moczu. 2. Tło biologiczne to w głównej mierze mieszanina niskocząsteczkowych związków organicznych o budowie alifatycznej, co stanowi istotną przyczynę problemów ana-litycznych i opiniodawczych w analizie amfetamin; jego wpływ wzrasta proporcjonalnie w miarę upływu czasu, w jakim materiał biologiczny ulega samoistnemu rozkła-dowi, a notowana reaktywność krzyżowa dotyczy zarówno metod immunologicznych, jak również chromatograficznych (HPLC-DAD). 3. Metoda 1H NMR może być stosowana jako metoda konfirmacyjna na obecność amfetamin w materiale biologicznym dla potwierdzenia dodatnich wyników uzy-skanych metodami immunoenzymatycznymi w analizie toksykologiczno-sądowej.
H a s ł a: amfetaminy – toksykologia sądowa – tło biolo-giczne – NMR.
Wstęp
Laboratoryjna diagnostyka zatruć amfetaminą oraz jej pochodnymi jest procesem złożonym i wymaga za-stosowania odpowiedniej aparatury naukowo-badawczej, a także odpowiedniej interpretacji otrzymanych wyników.
Wymagania dotyczące aparatury to przede wszystkim odpowiednia czułość, selektywność oraz dokładność oznaczenia. Stosowane powszechnie metody immuno-logiczne charakteryzują: odpowiednio wysoka czułość, prostota oznaczenia oraz brak konieczności izolacji kse-nobiotyku z matrycy biologicznej, a zatem i szybkość wykonania pomiaru. Jednak ich niska specyficzność substratowa może być przyczyną fałszywie dodatnich wyników analizy toksykologicznej. Zjawisko to, zwane reaktywnością krzyżową, występuje szczególnie często w analizie zdegradowanego materiału biologicznego – płynów ustrojowych, moczu oraz tkanek i narządów – w wyniku zachodzących przemian pośmiertnych (ta-natochemia, materiał sekcyjny).
W sądowo-toksykologicznej analizie amfetamin w ma-teriale sekcyjnym szczególnie ważny jest problem tzw. tła biologicznego. Często uzyskiwane dodatnie wyniki analizy metodami immunologicznymi okazują się być błędne, zafał-szowane są bowiem wpływem interferującym endogennych związków organicznych. Niezwykle ważne jest zatem, aby dodatnie wyniki analizy, szczególnie materiału sekcyjnego o znacznym stopniu rozkładu, potwierdzać metodą anali-tyczną opartą na innej zasadzie pomiaru.
W niniejszej pracy przyjęto trzy główne kierunki badań:
1. Oceny tła biologicznego – jego charakteru, składu oraz wpływu czasu na pojawienie się nowych, endogen-nych substancji chemiczendogen-nych mogących ingerować w wy-nik toksykologicznej analizy amfetamin w biologicznym materiale pośmiertnym. Pracę oparto na materiale, w któ-rym wykluczono obecność substancji pochodzenia egzo-gennego, następnie poddano kontrolowanemu rozkładowi w warunkach +4°C. Ponadto podjęto próbę molekularnej interpretacji zjawiska interferencji ze strony tła biologicz-nego w immunologiczne techniki pomiarowe w oparciu o wyliczenia kwantowe i podobieństwa w budowie znanych cząstek mogących zawierać się w matrycy do cząsteczki amfetaminy.
2. Opracowania metod konfirmacyjnych – opracowano własną metodę analityczną umożliwiającą potwierdzanie dodatnich wyników analizy toksykologicznej na obecność amfetaminy oraz metamfetaminy. Metoda chromatograficzna została zwalidowana, ustalono odpowiednie granice wykry-walności, oznaczalności oraz powtarzalność oznaczeń.
3. Wykazania przydatności spektrometrii magnetycz-nego rezonansu jądrowego w toksykologicznej analizie amfetamin w materiale biologicznym, jako referencyjnej metody konfirmacyjnej na obecność amfetamin w materiale biologicznym.
Materiał i metody
W badaniach nad charakterem tła biologicznego wyko-rzystano materiał biologiczny ośmiu osób, pobrany w czasie sekcji zwłok w celu przeprowadzenia rutynowych badań toksy kologicznych. Po wykluczeniu obecności ksenobio-tyków w procesie eksperckim, materiał dzielono i zabez-pieczano w szczelnych pojemnikach (pojemności 50 mL), następnie analizowano po określonym okresie przechowy-wania: 0, 30 i 90 dni. Badanym materiałem były: krew (5 mL), mocz (10 mL), wątroba (50 g), mózg (40 g), nerka (30 g). Przebadano łącznie 96 próbek.
Próbki moczu analizowano z użyciem chromatografu gazowego (GC, Chrom 5, Czechy) na kolumnie pakowa-nej, długości 3,5 m, wypełnionej 10% OV-17 na nośniku Carbowax W/AW. Aparat był zaopatrzony w standardowy detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID).
Materiał w badaniach nad charakterem tła biologicznego analizowano z użyciem chromatografu cieczowego HPLC--DAD, o następującej konfiguracji: pompa – Merck-Hitachi L-7100, interfejs – Merck-Hitachi D-7000, detektor – detek-tor fotodiodowy DAD Merck-Hitachi L-7455. Faza rucho-ma: odwrócony układzie faz, przepływ fazy izokratyczny 0,5 mL/min, skład (na 1 L): woda dejonizowana 530 mL, kwas ortofosforowy 80% 350 µL, trietyloamina 146 µL, acetonitryl 470 mL, alkalizacja za pomocą 10% KOH do pH = 3,3. Kolumna chromatograficzna: LichroCART 125-4 Lichrospher 100 RP-18 (5 µm). Pętla dozująca: 20 µL.
Mocz wykorzystany do wykonania wzorcowych widm magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)
poszcze-DIAGNOSTYKA I OPINIOWANIE WYNIKÓW W SĄDOWO-TOKSYKOLOGICZNEJ ANALIZIE AMFETAMIN 49 gólnych amfetamin (próby zerowe) pobrano od zdrowych
ochotników. Krew, mocz oraz ekstrakty materiałów sek-cyjnych pobierano w ramach rutynowych badań toksyko-logicznych prowadzonych w procesie eksperckim. Pomiary NMR przeprowadzano na spektrometrze Bruker DPX-400 Avance, przy częstotliwości 400 MHz. Układ przestrzenny dla poszczególnych cząsteczek określano poprzez obliczenia kwantowe, minimalizując energię cząsteczki metodą mi-nimalizacji orbitali PM3. Powierzchnię orbitali oznaczono jako półprzezroczystą czerwono-niebieską powłokę, zna-kując potencjał elektrostatyczny cząsteczki (kolor niebieski – potencjał ujemny; kolor czerwony – potencjał dodatni).
Analizę statystyczną danych prowadzono z wykorzystaniem programu Statistica 6.0.
Analiza hPlC – ekstrakcja ciecz-ciecz
Ekstrakcje prowadzono wg metody Borkowskiego [1, 2]. Materiał biologiczny odważano, następnie dokładnie rozdrabniano i zalewano 50 mL wody destylowanej. Tak przygotowaną mieszaninę utrzymywano w temperaturze wrzenia przez 15 min, po czym odsączano fazę wodną od fazy stałej. Następnie fazę wodną, po oziębieniu do tem-peratury pokojowej, ekstrahowano z dodatkiem siarczanu sodowego eterem dietylowym w środowisku kwaśnym pH 1–2, po czym ponownie ekstrahowano w środowisku zasadowym pH > 12. Fazę wodną zakwaszano 12% roz-tworem wodnym kwasu solnego, alkalizowano nasyconym roztworem wody amoniakalnej. Powstałe ekstrakty pozo-stawiano do odparowania do sucha na wolnym powietrzu, pozostałość rozpuszczano w 0,5 mL bezwodnego etanolu.
Roztwór alkoholowy dozowano bezpośrednio na kolumnę chromatografu.
Własna metoda analizy techniką GC-fID – mikroesktrakcja
W stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 7 mL umieszczono 5 mL materiału (mocz). Następnie dodawano 600 µL 6N NaOH, po czym 100 µL chloroformowego roz-tworu eteru difenylowego (standard wewnętrzny). Probówkę wytrząsano na wytrząsarce „vortex” przez około 1 min, a na-stępnie wirowano przez 1 min przy 6000 obr./min. Po tym etapie dozowano 4 µL dolnej warstwy cieczy (warstwa chlo-roformowa) bezpośrednio na kolumnę chromatograficzną.
Analiza NMR
W badaniach NMR tła biologicznego ekstrakty otrzy-mane metodą Borkowskiego, jak w badaniach HPLC, od-parowywano do sucha, po czym rozpuszczano ponownie w 0,5 mL deuterowanym chloroformu i poddawano ana-lizie.
W celu wykonania wzorcowych widm 1H NMR poszcze-gólnych amfetamin rozpuszczano je w wodzie destylowanej do uzyskania stężenia 100 µg/mL w próbce. Do analizy pobierano 0,5 mL roztworu.
W bezpośredniej analizie krwi sekcyjnej pobierano 1 mL krwi, umieszczano w probówce typu „epffendrof”,
wirowano na wysokoobrotowej wirówce, pobierano 0,2 mL supernatantu, mieszając tą ilość z 300 mL wody destylo-wanej i poddawano analizie bezpośredniej z supresją wody przez presaturacje.
W pracy nad wstępną obróbką fizykochemiczną krwi pobierano 0,5 mL krwi, umieszczano ją w probówce typu
„epffendrof”, następnie dodawano nasycony roztwór chlorku rtęci (II) (HgCl2) w ilości 0,5 mL, po czym wirowano na wysokoobrotowej wirówce. Następnie pobierano 0,2 mL supernatantu, mieszano z 0,5 mL wody destylowanej i po-nownie wirowano. Pobierano 0,5 mL supernatantu i pod-dawano analizie bezpośredniej z supresją wody przez pre-saturacje.
Próbki moczu w analizie bezpośredniej zakwaszano 12% roztworem wodnym kwasu solnego bądź alkalizowano 3 N roztworem wodorotlenku sodowego (3 N NaOH) do ustalenia wartości pH 5,8, po czym poddawano analizie bezpośredniej z supresją wody przez presaturacje.
Wyniki
Własna metoda analizy amfetaminy oraz metamfetaminy techniką GC-fID
Najczęściej i najskuteczniej wykorzystywane układy w toksykologicznej analizie amfetamin to, ze względu na dużą selektywność i czułość detektorów masowych, spek-trometria masowa w połączeniu z technikami chromatogra-ficznymi GC-MS, HPLC-MS. Poszukuje się także innych rozwiązań wstępnej obróbki i przygotowania materiału biologicznego. Przykładami mogą być:
– technika mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej w fazie nadpowierzchniowej (HS-SPME-GC-FID) [3],
– mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej [4],
– derywatyzacja „on-line i wstępna obróbka materiału z zastosowaniem pre-kolumn [5],
– mikroekstrakcja rozpuszczalnikowa (SME) [6, 7].
Podjęto próbę opracowania nowej procedury anali-tycznej, która mogłaby, w warunkach Zakładu Medycyny Sądowej Pomorskiej Akademii Medycznej, służyć do potwierdzania dodatnich wyników analizy na obecność amfetamin otrzymanych metodami immunologiczny-mi. Dokonano walidacji metody dla amfetaminy w za-kresie 500–9000 ng oraz metamfetaminy 1000–7000 ng.
Poprawność oznaczeń oraz kontrolę przeprowadzono z wy-korzystaniem próbki wzorcowej o składzie przedstawionym w tabeli 1. Uzyskano krzywe kalibracyjne dla metamfeta-miny (y = 1948,4x + 656,56; r2 = 0,9935) i dla amfetaminy (y = 2876,8x + 351,45; r2 = 0,9995).
Ustalono, że opisana metoda może być wykorzystana do analizy amfetaminy w zakresie stężeń 500–9000 ng/mL oraz metamfetaminy w zakresie stężeń 1000–7000 ng/mL.
W granicach tych stężeń uzyskano liniowość, odpowiednio niskie granice oznaczalności i wykrywalności oraz wartości r2 bliskie 1.
50 TOMASZ JANUS
badania nad charakterem tła biologicznego w biologicznym materiale pośmiertnym
Chemiczny charakter tła biologicznego badano na ma-teriałach, w których wykluczono w badaniach wstępnych obecność substancji egzogennych, następnie przechowywa-nych w warunkach +4°C. Wykorzystano powszechny układ analityczny, chromatografię cieczową z detekcją fotodiodową (HPLC-DAD). Materiał biologiczny, poddany rozkłado-wi, analizowano pod kątem korelacji pików sygnałów tła biologicznego z widmową bazą danych substancji egzo-gennych, w tym amfetamin. Oceniano charakter widmowy pików tła biologicznego w zakresie promieniowania UV (200–360 nm).
Substancje identyfikowane w wyniku rutynowej procedury analitycznej w układzie hPlC-DAD
Materiał biologiczny poddano analizie chromatograficz-nej, następnie korelowano poszczególne piki z biblioteką widmową. Przykładowe otrzymane wyniki korelacji przed-stawiono w tabeli 2, a ogólną ocenę statystyczną w tabeli 3.
Dla notowanego piku spisywano trzy pierwsze substancje największej zgodności widmowej identyfikowane przez program komputerowy.
Zdegradowany materiał biologiczny, ulegający dyna-micznym przemianom tanatochedyna-micznym, wykazywał charakter widmowy w zakresie promieniowania ultra-fioletowego (200–360 nm) zbliżony do charakterystyki widmowej amfetaminy, co pokazano na rycinie 1. Wy-raźnie zaznaczone dwa punkty przegięcia na widmie, w pobliżu 220 oraz 275 nm (szara linia widmo wzorca amfetaminy) pokrywają się z punktami dla substancji
matrycowych (linia zielona). Jedynie w obszarze około 215 nm widoczne są wyraźne różnice w przebiegu obu linii.
T a b e l a 1. Statystyczna ocena wyników otrzymanych dla odpowiednich punktów krzywej kalibracyjnej T a b l e 1. Statistical analysis of the results obtained for corresponding points of the calibration curve
Narkotyk Drug Stężenie Concentration Liczba powtórzeń Number of tests N-ważnych N-valid P. ufn. -95% Confidence interval -95% P. ufn. +95% Confidence interval +95% Średnia Mean Odchylenie standardowe Standard de- viation Błąd standardowy Standard error
Amfetamina Amphetamine
0,5 6 6 0,585 0,615 0,600 0,014 0,006
1,0 3 3 0,871 1,030 0,951 0,032 0,018
3,0 3 3 2,774 3,012 2,893 0,048 0,028
5,0 3 3 4,577 5,570 5,073 0,200 0,115
7,0 3 3 6,494 7,594 7,044 0,221 0,128
9,0 5 5 8,896 10,090 9,493 0,480 0,215
Metamfetamina Methamphetamine 1,0 3 3 0,928 1,020 0,974 0,019 0,110
2,0 3 3 1,574 2,148 1,861 0,115 0,067
3,0 3 3 2,587 2,762 2,675 0,035 0,020
4,0 3 3 4,075 4,276 4,176 0,040 0,023
5,0 3 3 4,986 5,342 5,164 0,071 0,041
7,0 5 5 5,597 7,263 6,930 0,268 0,120
Ryc. 1. Widmo UV tła biologicznego (linia pogrubiona) oraz wzorca amfetaminy (linia czarna) w zakresie 200–360 nm
Fig. 1. UV spectra of biological material (bold line) and amphetamine standard (black line) in the 200–360 nm range
Odnotowano 600 korelacji oraz stwierdzono 47 amfe-tamin (8% z całości).
Wpływ czasu przechowywania próbki na pojawianie się nowych substancji endogennych badany
w układzie hPlC-DAD
Na rycinie 2 przedstawiono chromatogramy wyciągów badanego materiału biologicznego, obrazując wpływ czasu przechowywania próbki na pojawienie się nowych endo-gennych substancji organicznych.
DIAGNOSTYKA I OPINIOWANIE WYNIKÓW W SĄDOWO-TOKSYKOLOGICZNEJ ANALIZIE AMFETAMIN 51
T a b e l a 2. Ksenobiotyki identyfikowane w analizie hPlC – pacjent AD T a b l e 2. Xenobiotics detected by hPlC: patient AD
Próbka Sample
Materiał biolog.
biolog.
material
Seria
Series Identyfikowany ksenobiotyk (korelacja)
Xenobiotic detected (correlation)
Czas Ret. ret.
time
AD
bloodkrew
czas zerowy
time 0 Ibuprofen (0,966); Salbutamol (0,961); Tramadol (0,961) –
po 30 dniach
after 30 days Selegilina (0,972); Amfetamina (0,967); Haloporediol (0,969)
Selegiline (0.972); Amphetamine (0.967); Haloporediol (0.969) – po 90 dniach
after 90 days Pantoprazol (0,982); Klomipramina (0,982); Diklofenak (0,972)
Pantoprazol (0.982); Klomipramine (0.982); Diclofenak (0.972) –
mózgbrain
czas zerowy time 0
Fenytoina / Phenytoine (0,975); Fenobarbital / Phenobarbital (0,968);
Ibuprofen (0,959) 2,69
Fenytoina / Phenytoine (0,979); Fenobarbital / Phenobarbital (0,965);
Ibuprofen (0,960) 2,48
Haloperidol (0,970); Imipramina / Imipramine (0,964); Mazindol (0,961) 2,27 po 30 dniach
after 30 days Ibuprofen (0,977); Fenytoina / Phenytoine (0,962); Salbutamol (0,957) 2,77 Ibuprofen (0,971); Tramadol (0,961); Salbutamol (0,964) 2,53
po 90 dniach after 90 days
Selegilina (0,996); Deksfenfluramina (0,989); Cyklobarbital (0,983)
Selegiline (0.996); Deksphenfluramine (0.989); Cyclobarbital (0.983) 4,40 Selegilina (0,9811); Cyklobarbital (0,9811); Deksfenfluramina (0,972)
Selegiline (0,9811); Cyclobarbital (0,9811); Deksphenfluramine (0,972) 3,52 Fenytoina (0,989); Fenobarbital (0,988); Cyklobarbital (0,986)
Phenytoine (0.989); Phenobarbital (0.988); Cyclobarbital (0.986) 2,77
nerka kidney
czas zerowy time 0
Paracetamol (0,977); Haloperidol (0,970); Ketokonazol / Ketoconazol (0,959) 5,12 Mazindol (0,984); Mianseryna / Mianserine (0,977); Hydroksyzyna /
Hydroksyzine (0,976) 2,83
Mazindol (0,980); Fenytoina / Phenytoine (0,978); Hydroksyzyna /
Hydroksyzine (0,978) 2,64
Fenytoina (0,981); Hydroksyzyna (0,978); Cetyryzyna (0,977)
Phenytoine (0.981); Hydroksyzine (0.978); Cetyryzine (0.977) 2,43
po 30 dniach after 30 days
Haloperidol (0,966); Klomipramina / Clomipramine (0,965); Diklofenak / Diclofenak
(0,960) 5,12
Diklofenak (0,959); Klomipramina / Clomipramine (0,958); Metamizol / Metamizol
(0,957) 4,40
Ibuprofen (0,982); Amfetamina / Amphetamine (0,980); Selegilina / Selegiline (0,960) 2,67 Mazindol (0,975); Amfetamina / Amphetamine (0,971); Mianseryna /
Mianserine (0,966) 1,87
po 90 dniach after 90 days
Klomipramina / Clomipramine (0,987); Mazindol (0,972); Midazolam (0,969) 5,49 Kwas mefamowy (0,984); Klomipramina (0,977); Klonazepam (0,968)
Mephamic acid (0.984); Clomipramine (0.977); Clonazepam (0.968) 4,16 Amfetamina (0,961); Klomipramina (0,959); Kwas mefamowy (0,956)
Amphetamine (0.961); Clomipramine (0.959); Maphamic acid (0.956) 2,96
wątroba liver
czas zerowy time 0
Paracetamol (0,981); Metamizol (0,966); Fenazon / Phenazon (0,957) 6,03 Fenytoina (0,986); Fenobarbital (0,982); Cyklobarbital (0,979)
Phenytoine (0.986); Phenobarbital (0.982); Cyclobarbital (0.979) 2,75 Fenytoina (0,986); Fenobarbital (0,980); Cyklobarbital (0,975)
Phenytoine (0.986); Phenobarbital (0.980); Cyclobarbital (0.975) 2,51 po 30 dniach
after 30 days
Metamizol (0,987); Fenazon / Phenazon (0,971); Klonazepam / Clonazepam (0,971) 5,12 Metamizol (0,988); Aminofenazon / Aminophenazon (0,981); Diklofenak /
Diclophenak (0,981) 2,67
po 90 dniach after 90 days
Klomipramina (0,973); Kwas mefamowy (0,965); Amfetamina (0,963)
Clomipramine (0.973); Mephamic acid (0.965); Amphetamine (0.963) 2,99 Kwas mefamowy / Mephamic acid (0,962); Klomipramina / Clomipramine (0,956);
Alprazolam (0,955) 2,75
Kwas mefamowy / Mephamic acid (0,973); Klomipramina / Clomipramine (0,968);
Alprazolam (0,942) 2,43
52 TOMASZ JANUS T a b e l a 3. Statystyczna ocena wyników analizy hPlC materiału biologicznego w odniesieniu do częstości wyboru amfetaminy T a b l e 3. Statistical analysis of hPlC results for the biological material with reference to the frequency of amphetamine selection
Parametry
Parameters Czas zerowy
Time 0 Po 30 dniach
After 30 days Po 90 dniach
After 90 days łącznie
Total %
Krewblood 0 2 3 5 11
Mózgbrain 1 2 12 15 32
Mocz / nerka
Urine / kidney 0 6 7 13 27
Wątroba
Liver 1 2 11 14 30
SumaTotal 2 12 33 47 –
% 4 25 71 – –
T a b e l a 4. Przesunięcia chemiczne poszczególnych protonów w cząsteczce amfetamin T a b l e 4. Chemical shifts of protons in the amphetamine molecule
Narkotyk/sygnał
Drug/signal 1 (s)
(ppm) 2 (Ar)
(ppm) 3 (d)
(ppm) 4 (sek)
(ppm) 5 (d)
(ppm) 6 (s)
(ppm) Amfetamina
Amphetamine – 7,32–7,45 2,94; 2,95 3,64 1,30; 1,32 –
Metamfetamina
Methamphetamine – 7,30–7,47 2,90; 2,91 3,53 1,27; 1,28 2,60
MDA 5,94 6,76–6,87 2,85; 2,86 3,50 1,28; 1,29 –
MDMA 5,98 6,77–6,86 2,87; 2,88 3,53 1,25; 1,26 2,70
s – singlet / singlet; Ar – pierścień aromatyczny / aromatic ring; d – dublet / dublet; sek – sekstet / sextet
Ryc. 2. Chromatogramy wyciągu: a) krwi; b) mózgu; c) nerki oraz d) wątroby pacjenta AD Fig. 2. Chromatograms of the extract from a) blood; b) brain; c) kidney and d) liver of patient AD
DIAGNOSTYKA I OPINIOWANIE WYNIKÓW W SĄDOWO-TOKSYKOLOGICZNEJ ANALIZIE AMFETAMIN 53 Ocena składników tła biologicznego z zastosowaniem
protonowego magnetycznego rezonansu jądrowego W kolejnym etapie pracy podjęto próbę wykorzystania techniki spektrometrii magnetycznego rezonansu jądrowego, przeprowadzając badania tych próbek, w których stwierdzo-ne we wstępnych testach przesiewowych dodatnie wyniki analizy immunologicznej nie zostały potwierdzone metodą konfirmacyjną, a zatem istniała pewność, że dodatni wynik analizy spowodowany był tłem biologicznym. Widmo 1H NMR substancji wyizolowanych z wątroby, przedstawiono na rycinie 3. Można na nim wyróżnić następujące sygnały:
a) dwa dublety w pobliżu 1 ppm–protony alifatyczne;
b) trzy sygnały w postaci dublet, szeroki singlet oraz du-blet w zakresie 1,5–2,4 ppm – protony położone w pobliżu grupy ketonowej;
c) trzy sygnały: singlet, dublet oraz singlet – protony po-łożone w sąsiedztwie grupy;
d) szeroki sygnał protonów wody w zakresie 4,6–
–5,0 ppm;
e) grupa sygnału pierścienia aromatycznego w zakresie 7,3–7,5 ppm.
na oraz układ ładunków na jej powierzchni. Opracowano modele poszczególnych amfetamin, izomerów struktural-nych amfetaminy oraz najbardziej zbliżostruktural-nych pod względem budowy chemicznej związków matrycowych. Wygenero-wano obraz przestrzenny molekuł w stanie o najmniejszej energii cząsteczki, oznaczając rozkład potencjału elek-trostatycznego na ich powierzchni. Budowę strukturalną amfetaminy w układzie przestrzennym, z wykorzystaniem metod chemicznych, obliczeń semi-empirycznych metod kwantowych porównano względem siebie, na rycinie 4, gdzie przedstawiono modele czterech najpopularniejszych amfetamin.
Ryc. 3. Widmo 1H NMR wątroby po ekstrakcji, w której stwierdzono amfetaminę w badaniu FPIA
Fig. 3. 1H NMR spectra of the liver after extraction when amphetamine was detected with EPIA
Dokładniejszy obraz sygnałów w rejonie alifatycznym wraz z przeprowadzoną integracją pozwala stwierdzić, że poszczególne protony pozostają w innych, niż jak to ma miejsce w przypadku amfetaminy, wzajemnych propor-cjach ilościowych oraz wykazują odmienne przesunięcia chemiczne.
Reaktywność krzyżowa metod immunologicznych a wynik analizy toksykologicznej amfetaminy i jej pochodnych w aspekcie molekularnym
Charakterystyczną cechą każdej molekuły wchodzącej w reakcje antygen–przeciwciało jest jej budowa
przestrzen-a) b)
c) d)
Ryc. 4. Struktura przestrzenna amfetamin: a) amfetaminy;
b) metamfetaminy; c) MDA; d) MDMA Fig. 4. Spatial structure of amphetamines: a) amphetamine;
b) methamphetamine; c) MDA; d) MDMA
Izomery optyczne, D- oraz L-amfetaminy wykazują również różnice w budowie przestrzennej z punktu widze-nia miejsc wiążących oraz różnice w rozkładzie potencjału elektrostatycznego. Zatem poszczególne aminy różniące się budową strukturalną tym bardziej różnie reagować będą w reakcji antygen–przeciwciało.
Wykonanie wzorcowych widm 1h NMR amfetamin w roztworach wodnych
W pierwszej fazie badań wykonano szereg widm dla najpopularniejszych amfetamin w roztworach wodnych.
Przesunięcia chemiczne dla poszczególnych amfetamin przedstawiono w tabeli 4, natomiast przykładowe widmo amfetaminy na rycinie 5.
Wodne roztwory wzorcowych amfetamin dają rozróż-nialne sygnały w widmie 1H NMR, a oznaczona granica wykrywalności dla amfetaminy wynosi 1 µg/mL dla roz-tworów wodnych w analizie bezpośredniej.
54 TOMASZ JANUS
bezpośrednia analiza krwi zhemolizowanej, rozłożonej w wyniku przemian pośmiertnych o znacznym stopniu rozkładu
Krew jest podstawowym materiałem biologicznym w toksykologicznej diagnostyce medyczno-sądowej, dlatego też badania nad zastosowaniem 1H NMR rozpoczęto od tego materiału. Typowe widmo krwi w analizie bezpośredniej, bez jakiejkolwiek obróbki fizykochemicznej przedstawiono na rycinie 6. Na przedstawionym widmie wyróżnić można następujące grupy sygnałów:
a) dwa sygnały intensywne – szerokie pasma sygnałów w zakresie 1,1–1,3 ppm – sygnały protonów grup alifatycz-nych -CH3, głównie aminokwasów;
b) trzy intensywne szerokie pasma sygnałów w zakresie 1,7–2,4 ppm – sygnały protonów związanych z węglem leżą-cym w sąsiedztwie grup ketonowych, w tym ciała ketonowe, N-acetylowane glikoproteiny, acetyloaceton itp.;
c) niewielkiej intensywności pasma sygnałów w zakresie 2,5–4,0 ppm – sygnały protonów związanych z węglem leżącym w sąsiedztwie grup aminowych i amidowych, głównie związki N-metylowane;
d) szerokie intensywne pasmo w okolicach 5,0 ppm po-chodzące od protonów wody H2O;
e) niewielkiej intensywności pasma sygnałów w zakresie 7,0–8,0 ppm – sygnały silnie odsłanianych protonów pier-ścienia aromatycznego.
Ze względu na nieczytelność widm w bezpośredniej analizie krwi, podjęto dalsze badania mające na celu eli-minację alifatycznych sygnałów białkowych.
Analiza krwi sekcyjnej poddanej obróbce chemicznej, mającej na celu usunięcie substancji wielkocząsteczkowych
Krew poddano wstępnej obróbce fizykochemicznej, odbiałczaniu z zastosowaniem chlorku rtęci (II) HgCl2, a następnie wirowaniu w wysokowydajnej wirówce
obro-towej. Na rycinie 7 przedstawiono widmo krwi po wstępnej obróbce fizykochemicznej. Na przedstawionym widmie wyróżnić można następujące grupy sygnałów:
a) pięć sygnałów w postaci intensywnych, szerokich pasm w zakresie 1,1–1,6 ppm – sygnały protonów grup alifatycz-nych -CH3, głównie aminokwasów;
b) cztery intensywne szerokie pasma sygnałów w zakresie 1,7–2,4 ppm – sygnały protonów związanych z węglem leżą-cym w sąsiedztwie grup ketonowych, w tym ciała ketonowe, N-acetylowane glikoproteiny, acetyloaceton itp.;
c) niewielkiej intensywności pasma sygnałów w zakresie 2,5–4,0 ppm – sygnały protonów związanych z węglem leżącym w sąsiedztwie grup aminowych i amidowych, głównie związki N-metylowane;
d) szerokie intensywne pasmo w okolicach 5,0 ppm po-chodzące od protonów wody H2O;
e) niewielkiej intensywności pasma sygnałów w zakre-sie 7,0–8,5 ppm – sygnały silnie odsłanianych protonów pierścienia aromatycznego oraz protonów sąsiadujących z grupą karboksylową.
Powyższe sygnały są obrazem endogennych składników krwi, które uniemożliwiają identyfikacje innych substancji egzogennych.
bezpośrednia analiza moczu
Najczęściej wykorzystywanym materiałem biologicznym do celów diagnostyczno-opiniodawczych w sądowo-toksy-kologicznej analizie chemicznej jest mocz, który obok krwi pacjenta stanowi tzw. materiał podstawowy. Widmo 1H NMR moczu fizjologicznego, w którym wykluczono obecność sub-stancji egzogennych, przedstawiono na rycinie 8. Wyróżnić
Najczęściej wykorzystywanym materiałem biologicznym do celów diagnostyczno-opiniodawczych w sądowo-toksy-kologicznej analizie chemicznej jest mocz, który obok krwi pacjenta stanowi tzw. materiał podstawowy. Widmo 1H NMR moczu fizjologicznego, w którym wykluczono obecność sub-stancji egzogennych, przedstawiono na rycinie 8. Wyróżnić