Materiał badawczy stanowiły erytrocyty krwi obwo-dowej, pobranej na czczo od 25 zdrowych osób (12 kobiet i 13 mężczyzn) w wieku 28–54 lat, u których oznaczono wyjściowe stężenie glukozy w osoczu metodą enzyma-tyczną (Aqua Medica, łódź). Próbę kontrolną stanowiły erytrocyty krwi, w której stężenie glukozy na czczo nie przekraczało 90 mg/dL (5 mmol/L), inkubowane przez 90 min w temp. 37°C bez domieszki glukozy. W próbach badanych erytrocyty poddano działaniu glukozy o stęże-niach 120 mg/dL (6,66 mmol/L) i 180 mg/dL (9,99 mmol/L) przez 90 min w temp. 37°C. Dodając do prób badanych po 0,1 mL roztworu glukozy o odpowiednio większym stężeniu, uzyskiwano stężenia oczekiwane: 120 mg/dL i 180 mg/dL.
Oporność osmotyczną (oporność na działanie roztworów NaCl o stężeniach 10–150 mmol/L) i saponinową (oporność na działanie roztworów saponiny o stężeniach 5–35 mg/L) oznaczano metodą spektrofotometryczną.
Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczono war-tości F50, czyli stężenia NaCl lub saponiny, wobec których 50% erytrocytów ulegało hemolizie.
Wskaźnikiem hemolizy krwinek czerwonych w wa-runkach eksperymentu było stężenie hemoglobiny poza-krwinkowej w osoczu uzyskanym po odwirowaniu krwi (2500 rpm; 10 min), uprzednio inkubowanej przez 90 min w temp. 37°C w roztworach o odpowiednich stężeniach glukozy. Stężenie hemoglobiny pozakrwinkowej oznaczano metodą spektrofotometryczną.
Wyniki opracowano statystyczne przy użyciu programu Statistica Pl v 6.1 (StatSoft, Kraków). Zastosowano test t-Studenta dla zmiennych zależnych. Istotność statystyczną przyjęto na poziomie p < 0,05.
Wyniki
Średnie wartości współczynników F50 charakteryzują-cych oporność osmotyczną i saponinową erytrocytów oraz wartości stężeń hemoglobiny pozakrwinkowej w osoczu krwi zamieszczono w tabeli 1. Oporność osmotyczna ule-gła istotnemu zmniejszeniu podczas inkubacji erytrocy-tów w roztworze glukozy o stężeniu 120 mg/dL (p < 0,05).
Wzrost stężenia glukozy do 180 mg/dL spowodował dalsze zwiększenie średniej wartości F50 (p < 0,05). Oporność saponinowa, mierzona we krwi o prawidłowym stężeniu glu-kozy, ulegała istotnej poprawie, począwszy od erytrocytów inkubowanych w roztworze glukozy o stężeniu 120 mg/dL (p < 0,001), a następnie 180 mg/dL (p < 0,0001). Stężenia hemoglobiny pozakrwinkowej zwiększały się istotnie wraz ze wzrostem stężeń glukozy w roztworze inkubacyjnym.
WPłYW GLUKOZY NA ZMIANY OPORNOŚCI HEMOLITYCZNEJ ERYTROCYTÓW – BADANIA IN VITRO 27
Dyskusja
Na podstawie badań własnych wykazano, że krót-kotrwała umiarkowana hiperglikemia rzędu 120 mg/dL, stwierdzana in vivo w warunkach prawidłowych w okresie resorpcyjnym, wywołuje zmniejszenie oporności osmo-tycznej erytrocytów.
Glukoza jest wykorzystywana przez erytrocyty jako sub-strat energetyczny oraz do tworzenia systemu ochrony anty-oksydacyjnej [2]. Szlak heksozomonofosforanowy generuje NADPH + H+,niezbędny do redukcji stale powstającej methe-moglobiny oraz utrzymania glutationu zredukowanego (GSH) w optymalnym dla krwinki stężeniu. Odpowiednia zawartość GSH w erytrocytach chroni je przed hemolizą, a grupy tiolowe enzymów i hemoglobiny przed utlenieniem [3].
Utrzymanie optymalnego stężenia GSH jest możliwe dzięki obecności reduktazy glutationowej, której koenzymem jest NADPH + H+.Zmniejszenie stężenia GSH w erytrocytach
< 40% wartości prawidłowej prowadzi do hemolizy krwinek [2]. Erytrocyty są wyposażone w bardzo efektywną ochro-nę antyoksydacyjną. Stwierdza się w nich duże aktywności najważniejszych enzymów antyoksydacyjnych [4, 5].
Glukoza prowadzi do inaktywacji enzymów i zmian strukturalnych białek w dojrzałych erytrocytach [6]. Ważną modyfikacją jest glikacja, której nasilenie jest traktowane jako wskaźnik stężenia glukozy we krwi lub miara długości życia erytrocytów. Glikacja może prowadzić do inaktywacji białek [7]. Kilkudniowa inkubacja erytrocytów w buforowa-nym roztworze glukozy prowadzi do zmniejszenia aktyw-ności enzymów glikolitycznych i antyoksydacyjnych. Doty-czy to dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy [5] i reduktazy glutationowej [8]. Skutkiem tych zmian jest zmniejszenie oporności erytrocytów na bodźce osmotyczne, podobne do obserwowanych u osób z wrodzonymi defektami enzymów glikolizy lub szlaku HMP [9, 10, 11].
Zmiany konformacyjne, powodowane przez gluko-zę, dotyczą grup tiolowych białek i zachodzą nawet przy krótkotrwałej hiperglikemii wywołanej w warunkach in vitro. U osób chorych na cukrzycę ma miejsce nasilenie procesów glikacji i oksydacji białek osocza, hemoglobiny i białek błon erytrocytarnych [12]. Stopień glikacji białek błonowych erytrocyta jest dwukrotnie większy w porów-naniu z hemoglobiną. Prowadzi to do zmniejszenia zawar-tości wielonienasyconych kwasów tluszczowych, np. kwasu arachidonowego (20:4) w błonie komórkowej. Zjawisko to zostało określone jako początek komórkowego procesu sta-rzenia [7, 12].
Resmi i wsp. [7, 12] stwierdzili, że nasilenie stresu oksydacyjnego powodowanego przez glukozę w warunkach in vitro zależy od jej stężenia i czasu inkubacji. Nieen-zymatyczna glikacja białek błonowych jest jednym z naj-ważniejszych czynników przyczyniających się do zmian właściwości dynamicznych błon erytrocytarnych w stanie cukrzycy [7].
Erytrocyty poddane nawet krótkotrwałemu działaniu glukozy w stężeniach wyższych od fizjologicznych tracą swoją oporność osmotyczną, co przekłada się na wzrost he-molizy i zwiększenie stężenia hemoglobiny pozakrwinkowej w osoczu. Podobne skutki zaobserwowano w niniejszych ba-daniach. W warunkach fizjologicznych wzrostowi glikemii towarzyszy proporcjonalny wzrost stężenia insuliny, która in vivo poprawia zmniejszoną odkształcalność erytrocytów stwierdzaną u pacjentów z cukrzycą typu 1 [7, 12].
Do głównych egzogennych czynników chemicznych wpływających na modyfikację oporności hemolitycznej erytrocytów in vivo zaliczane są trucizny środowiskowe i przemysłowe, takie jak benzen, ołów [13, 14, 15, 16] i nie-które pestycydy [17, 18, 19]. W warunkach in vitro są to fenol, nitrobenzen, detergenty i czynniki zmydlające, m.in.
saponina [20, 21, 22, 23], które poprzez zmianę ładunku
po-T a b e l a 1. Oporność osmotyczna i saponinowa erytrocytów oraz stężenia hemoglobiny pozakrwinkowej w osoczu krwi poddanej działaniu glukozy (n = 25)
T a b l e 1. Osmotic and saponin resistance of erythrocytes and extracellular hemoglobin concentrations in plasma following incubation of whole blood with glucose (n = 25)
Parametry (mg Hb/dL osocza / of plasma) Stężenie glukozy
istotność różnic pomiędzy wartościami parametrów we krwi, w której stężenie glukozy wynosiło: / significance of difference between parameters in blood with glucose concentration of:
a < 90 vs 120 mg/dL
b < 90 vs 180 mg/dL
c 120 vs 180 mg/dL
28 BARBARA DOłĘGOWSKA, WOJCIECH BłOGOWSKI, DARIUSZ CHLUBEK wierzchniowego i opłaszczenie składników błony powodują
jej destabilizację, a w konsekwencji hemolizę krwinki.
Poprawę oporności saponinowej erytrocytów poddanych działaniu bardzo dużych stężeń glukozy można wytłuma-czyć odmiennym mechanizmem działania tego czynnika hemolizującego. Saponina działa bezpośrednio na skład-niki błony komórkowej, zmieniając ich stosunki ilościowe.
Zmiany konformacyjne składników błony spowodowane działaniem dużych stężeń glukozy przeciwstawiają się jej destabilizacji przez saponinę.
Wniosek
Glukoza wpływa na oporność saponinową i osmotyczną erytrocytów. Krótkotrwała hiperglikemia powoduje zwięk-szenie wrażliwości erytrocytów na czynniki osmotyczne i jednocześnie wzrost ich oporności saponinowej.
Piśmiennictwo
1. Szafran H., Bojarski J.: Nośniki glukozowe. Diagn. Lab. 2005, 41, 171–198.
2. van Wijk R., van Solinge W.W.: The energy-less red blood cell is lost:
erythrocyte enzyme abnormalities of glycolysis. Blood, 2005, 106, 4034–4042.
3. Claro L.M., Leonart M.S., Comar S.R., do Nascimento A.J.: Effect of vitamins C and E on oxidative processes in human erythrocytes. Cell Biochem. Funct. 2005 (epubahead of print).
4. Siems W.G., Sommerburg O., Grune T.: Erythrocyte free radical and energy metabolism. Clin. Nephrol. 2000, 53, S9–S17.
5. Yan H., Harding J.J.: Glycation-induced inactivation and loss of anti-genicity of catalase and superoxide dismutase. Biochem. J. 1997, 328, 599–605.
6. Stepniewska J., Ciechanowski K.: Oxidative stress as a reason of tre-atment difficulties in chronic renal failure. Pol. Merkuriusz Lek. 2005, 19, 697–700.
7. Resmi H., Akhunlar H., Temiz Artmann A., Guner G.: In vitro effects of high glucose concentrations on membrane protein oxidation, G-actin and deformability of human erythrocytes. Cell Biochem. Funct. 2005, 23, 163–168.
8. Hunaiti A.A., Soud M.: Effect of lead concentration on the level of glutathione, glutathione S-transferase, reductase and peroxidase in human blood. Sci. Total Environ, 2000, 248, 45–50.
9. Orosz F., Olah J., Alvarez M., Keseru G.M., Szabo B., Wagner G. et al.:
Distinct behavior of mutant triosephosphate isomerase in hemolysate and isolated form: molecular basis of enzyme deficiency. Blood, 2001, 98, 3106–3112.
10. Assouline-Cohen M., Beitner R.: Effects of Ca2+ on erythrocyte mem-brane skeleton-bound phosphofructokinase, ATP levels, and hemolysis.
Mol. Genet. Metab. 1999, 66, 56–61.
11. Johnson R.M., Panchoosingh H., Goyette G. Jr., Ravindranath Y.: In-creased erythrocyte deformability in fetal erythropoiesis and in ery-throcytes deficient in glucose-6-phosphate dehydrogenase and other glycolytic enzymes. Pediatr. Res. 1999, 45, 106–113.
12. Resmi H., Pekcetin C., Guner G.: Erythrocyte membrane and cyto-skeletal protein glycation and oxidation in short-term diabetic rabbits.
Clin. Exp. Med. 2001, 1, 187–193.
13. Corchs J., Gioia I.A., Serrani R.E., Taborda D.: Lead ions but not other metallic ions increase resistance to hypotonic lysis in prenatal hemopoiesis red blood cells. Biocell, 2001, 25, 287–289.
14. Hunaiti A.A., Soud M.: Effect of lead concentration on the level of glutathione, glutathione S-transferase, reductase and peroxidase in human blood. Sci. Total Environ. 2000, 248, 45–50.
15. Kleszczynska H., Sarapuk J.: Influence of organic and inorganic ions on organolead-induced hemolysis of erythrocytes. Z. Naturforsch. 2001, 56, 853–856.
16. Mojzis J., Nistiar F.: Lead-induced changes of cation-osmotic hemolysis in rats. Gen. Physiol. Biophys. 2001, 20, 315–319.
17. Duchnowicz P., Koter M.: Damage to the erythrocyte membrane caused by chlorophenoxyacetic herbicides. Cell. Mol. Biol. Lett. 2003, 8, 25–30.
18. Kleszczynska H., Bonarska D., Bielecki K., Sarapuk J.: The hemolytic and physiological activities of mixtures of some phenoxy and organo-phosphorus herbicides. Cell. Mol. Biol. Lett. 2003, 8, 55–61.
19. Singh M., Sandhir R., Kiran R.: In vitro effects of organophosphate pe-sticides on rat erythrocytes. Indian. J. Exp. Biol. 2004, 42, 292–296.
20. Asokan A., Cho M.J.: Cytosolic delivery of macromolecules 4. Head group-dependent membrane permeabilization by pH-sensitive deter-gents. J. Control. Release. 2005, 1061, 146–153.
21. Rodriguez P., Rivas C.I., Godoy A., Villanueva M., Fischbarg J., Vera J.C. et al.: Redefining the facilitated transport of mannose in human cells: absence of glucose-insensitive, high-affinity facilitated mannose transport system. Biochemistry, 2005, 44, 313–320.
22. Takechi M., Doi K., Wakavama Y.: Biological activities of synthetic saponins and cardiac glycosides. Phytother. Res. 2003, 17, 83–85.
23. Rozin V.V.: The mechanism of hemolysis of erythrocytes by sodium dodecyl sulfate. Ann. NY Acad. Sci. 2005, 1048, 451–452.
ANNALES ACADEMIAE MEDICAE STETINENSIS
R O C Z N I K I P O M O R S K I E J A K A D E M I I M E D Y C Z N E J W S Z C Z E C I N I E ANNALS OF THE POMERANIAN MEDICAL UNIVERSITY
2006, 52, 3, 29–35
AGNIESZKA KEMPIŃSKA