Katedra i Zakład Biologii i Parazytologii Medycznej Pomorskiej Akademii Medycznej al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: prof. dr hab. n. med. Wanda Kuźna-Grygiel
Summary
Introduction: The aim of the study was to examine the effect of mould fungi isolated from soil and of two of their metabolites, aflatoxin G1 and ochratoxin A, on the embryonic development of eggs and mortality of larvae of Ascaris suum. An attempt was made to demonstrate syner-gism between fungi species in the action on embryogenesis of Ascaris suum.
Material and methods: Fungi were isolated from soil and cultured on the standard Czapek–Dox agar medium at 26°C for 60 days. Fertilized eggs of Ascaris suum were incubated in PBS solution with the mycelium of each spe-cies or without fungi in the control culture. To demonstrate synergism between fungi species, eggs were cultured with three combinations of two species. Additional cultures were done with aflatoxin G1 and ochratoxin A at concentrations of 0.5, 1, and 2 ppm.
Results: Microscopy showed a slower rate of develop-ment of eggs from experidevelop-mental cultures as compared to the control culture. Fungi, as well as mycotoxins, caused vacuolization of the zygote, uneven division of blastomeres, and morphological abnormalities of the embryo. The high-est mortality (36%) of invasive larvae of Ascaris suum was caused by Paecylomyces fumosoroseus. The present study revealed that the antagonistic effect of a fungi on the
devel-* Zwięzła wersja rozprawy doktorskiej przyjętej przez Radę Wydziału Lekarskiego Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie. Promotor:
prof. dr hab. n. med. Wanda Kuźna-Grygiel. Oryginalny maszynopis obejmuje: 87 stron, 21 rycin, 11 tabel, 142 pozycji piśmiennictwa.
* Concise version of doctoral thesis approved by the Council of the Faculty of Medicine, Pomeranian Medical University in Szczecin. Promotor:
Prof. Wanda Kuźna-Grygiel M.D., D.M.Sc. Habil. Original typescript comprises: 87 pages, 21 figures, 11 tables, 142 references.
opment of Ascaris suum eggs is increased or decreased in the presence of another fungi species. Exposure to aflatoxin G1 and ochratoxin A at concentrations as low as 0.5 ppm leads to a greater percentage of deformed embryos and 100%
mortality of larvae.
K e y w o r d s: geohelminths – saprotrophic fungi – As-caris suum – embryogenesis.
Streszczenie
Wstęp: Celem badań była ocena oddziaływania wyizo-lowanych z gleby grzybów pleśniowych oraz dwóch wy-branych metabolitów: aflatoksyny G1 i ochratoksyny A na rozwój zarodkowy jaj i śmiertelność larw Ascaris suum, jak również wykazanie ewentualnego synergizmu wybranych gatunków grzybów saprotroficznych w oddziaływaniu na embriogenezę Ascaris suum.
Materiał i metody: Wyizolowane z gleby szczepy grzy-bów hodowano na standardowym podłożu Czapek–Dox Agar, w temperaturze 26°C, przez 60 dni. Zapłodnione jaja Ascaris suum, inkubowane wraz z grzybnią poszczególnych gatunków, stanowiły hodowle doświadczalne. Natomiast hodowle kontrolne stanowiły jaja Ascaris suum w PBS.
W celu wykazania ewentualnego synergizmu w
oddzia-38 MAGDALENA JAbOROWSKA ływaniu badanych grzybów prowadzono obserwacje jaj
Ascaris suum inkubowanych w trzech rodzajach hodowli z dwoma wybranymi gatunkami grzybni jednocześnie.
Ponadto przeprowadzono doświadczenie z aflatoksyną G1 i ochratoksyną A w stężeniu 0,5, 1 i 2 ppm.
Wyniki: Obserwacje mikroskopowe wykazały wolniej-sze tempo rozwoju jaj w obecności grzybni w porównaniu z hodowlami kontrolnymi. Badane gatunki grzybów oraz wybrane mykotoksyny powodowały wakuolizację zygoty, nierównomierne podziały blastomerów oraz zaburzenia mor-fologiczne zarodków. Spośród badanych gatunków grzybów, największą śmiertelność larw inwazyjnych Ascaris suum (36%) powodował Paecylomyces fumosoroseus. badania udowodniły również, że antagonistyczne oddziaływanie grzybów pleśniowych na jaja Ascaris suum jest silniejsze lub słabsze w obecności innego gatunku grzyba. Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń wykazano, że w porówna-niu z grzybami, mykotoksyny (nawet w stężeporówna-niu 0,5 ppm) powodują znacznie wyższy odsetek zdeformowanych za-rodków oraz 100% śmiertelności larw.
H a s ł a: geohelminty – grzyby saprotroficzne – Ascaris suum – embriogeneza.
Wstęp
Poważnym zagrożeniem zdrowia publicznego jest za-nieczyszczenie gleby jajami pasożytniczych geohelmin-tów: Ascaris lumbricoides, Ascaris suum, Toxocara canis i Trichuris trichiura. Eliminacja jaj tych pasożytów to po-ważny i nadal nierozwiązany problem epidemiologiczny.
Ponieważ stosowanie jajobójczych środków chemicznych i fizycznych wiąże się z ubocznymi efektami szkodliwymi dla homeostazy ekosystemu glebowego, koniecznym stało się poszukiwanie czynników biotycznych w celu redukcji populacji geohelmintów. W świetle dotychczasowych badań, rolę takich bioregulatorów mogą pełnić saprotroficzne grzy-by pleśniowe współwystępujące z formami rozwojowymi pasożytów w glebie.
Celem badań była ocena oddziaływania wyizolowanych z gleby grzybów pleśniowych i wybranych mykotoksyn na rozwój zarodkowy jaj i śmiertelność larw Ascaris suum oraz wykazanie ewentualnego synergizmu wybranych ga-tunków grzybów.
Materiał i metody
Dojrzałe samice Ascaris suum otrzymywano z jelit świń bezpośrednio po uboju w Zakładach Mięsnych w Szczecinie.
Zapłodnione jaja pozyskiwano z końcowych odcinków macic o długości nieprzekraczającej 2 cm, a następnie umieszczo-no w roztworze PBS. W przygotowanej do doświadczeń zawiesinie znajdowało się ok. 106 jaj/mL. Przeprowadzono 3 rodzaje eksperymentów.
Doświadczenie 1 – z 11 gatunkami grzybów, które zo-stały wyizolowane z gleby i oznaczone w Zakładzie Entomo-logii Stosowanej Akademii Rolniczej w Szczecinie. Grzyby pasażowano na podłożu standardowym Czapek–Dox Agar w temperaturze 26ºC.
W szalkach Petriego o średnicy 5 cm umieszczono po 10 mL zawiesiny jaj Ascaris suum. Z każdym gatunkiem grzyba założono po 3 hodowle. W tym celu z 21-dniowych hodowli każdego gatunku grzyba wycinano krążki grzybni wraz z podłożem o średnicy 40 mm, a następnie po jednym krążku umieszczano w szalkach Petriego w zawiesinie jaj Ascaris suum. Jaja robaków inkubowane wraz z grzybnią poszczególnych gatunków stanowiły hodowle doświadczal-ne. Równolegle prowadzono hodowle kontrolne jaj – w PBS bez grzybów. Doświadczenie trwało 60 dni w temperaturze 26ºC. Od założenia hodowli prowadzono codzienne obser-wacje mikroskopowe (pow. ×400). Każdorazowo, wśród 300 losowo napotkanych jaj określano liczbę zygot, liczbę zarodków 2-blastomerowych, liczbę morul, blastul, gastrul oraz larw. Jednocześnie odnotowywano liczbę uszkodzonych lub nieprawidłowych zarodków. Dla oceny żywotności jaj stosowano barwienie roztworem jodu [1].
Doświadczenie 2 – przeprowadzono w celu wykazania ewentualnego synergizmu w oddziaływaniu badanych grzy-bów. Prowadzono obserwacje jaj Ascaris suum inkubowa-nych z dwoma wybranymi gatunkami grzybni jednocześnie.
Do doświadczenia wybrano:
– Paecilomyces fumosoroseus i Metarhizium flavoviride, – Trichocladium asperum i Stachybotrys chartarum, – Fusarium culmorum i Trichothecium roseum.
W szalkach Petriego umieszczono po 10 mL zawiesiny jaj Ascaris suum oraz 2 krążki grzybni wybranych par ga-tunków o średnicy 20 mm każdy. Obserwacje mikroskopowe prowadzono analogicznie jak z pojedynczymi gatunkami grzybni.
Doświadczenie 3 – przeprowadzono z aflatoksyną G1, otrzymaną z Aspergillus flavus i ochratoksyną A, otrzymaną z Aspergillus ochraceus (firmy Sigma). Mykotoksyny te rozcieńczono w wodzie destylowanej, sporządzając roztwory o stężeniu 0,5, 1 i 2 ppm. W trzech hodowlach doświad-czalnych umieszczano jaja z aflatoksyną G1o stężeniu 0,5 ppm, w kolejnych trzech z aflatoksyną G1o stężeniu 1 ppm, a w trzech z aflatoksyną G1o stężeniu 2 ppm. Analogicznie założono hodowle z ochratoksyną A w stężeniach 0,5, 1 i 2 ppm. Kontrolę stanowiły jaja inkubowane wyłącznie w PBS. Doświadczenie prowadzono do 60. dnia włącznie w temperaturze 26ºC. Analogicznie jak w doświadczeniu 1 i 2, w codziennych obserwacjach oceniano zaawansowanie embriogenezy oraz odsetek wad rozwojowych.
Do badań w mikroskopie elektronowym próbki jaj Asca-ris suum pobierano z hodowli kontrolnych i doświadczalnych w dniach inkubacji, w których stwierdzono istotne zmiany.
Jaja utrwalano 2% aldehydem glutarowym w 0,1 M buforze kakodylowym o pH 7,2. Po odwodnieniu w gradiencie alko-holi i w acetonie preparaty były suszone w punkcie krytycz-nym CO2 w temperaturze 32°C i naparowywane próżniowo
OGRANICZENIE LICZEBNOŚCI PASOŻYTNICZYCH GEOHELMINTÓW PRZEZ SAPROTROFICZNE GRZYBY GLEBOWE 39
T a b e l a 1. Czas trwania (w dniach) całego rozwoju zarodkowego jaj Ascaris suum i poszczególnych jego etapów T a b l e 1. Duration (in days) of embryogenesis of Ascaris suum eggs and of its stages
Hodowla Culture
Cały rozwój (od zygoty
do larwy) From zygote to
larva
2BLASTOMERY→
2 bLASTOMERES MORULA→
MORULA BLASTULA→
bLASTULA GASTRULA→
GASTRULA LARWA
LARVA
Kontrolna
Control 15 5 1 1 3 5
Penicillium
frequentans 29 11 3 1 3 11
Paecilomyces
fumosoroseus 49 21 1 3 1 23
Metarhizium
flavoviride 49 19 2 4 1 23
Metarhizium
anisopliae 43 18 4 1 2 18
Trichothecium
roseum 29 11 3 1 1 13
Fusarium
culmorum 28 10 1 3 2 12
Aspergillus
versicolor 36 14 4 3 3 12
Aspergillus
niger 43 11 1 5 5 21
Trichocladium
asperum 60 21 4 7 8 20
Stachybotrys
chartarum 22 10 2 5 1 4
Trichoderma
viride 36 18 9 3 3 3
stopem AuPd40. Preparaty obserwowano w mikroskopie skaningowym Jeol JSM6100 (Zakład Metaloznawstwa i Od-lewnictwa Politechniki Szczecińskiej).
Oceny istotności różnic między częstościami dokonano stosując test niezależności chi2 lub test niezależności chi2 z poprawką Yatesa. Za istotne statystyczne uznano różnice przy p ≤ 0,05.
Badania były przeprowadzone w oparciu o środki fi-nansowe KBN, w ramach projektu badawczego nr 2PO5D 022 26.
Wyniki
W tabeli 1 przedstawiono tempo rozwoju poszczegól-nych etapów embriogenezy Ascaris suum w hodowlach kontrolnych oraz inkubowanych z 11 gatunkami wyizo-lowanych grzybów glebowych. W porównaniu z hodow-lami kontrolnymi, rozwój jaj inkubowanych z grzybami, wszystkich badanych gatunków był znacznie wolniejszy, przy czym tempo rozwoju zależało od gatunku grzyba.
Z danych przedstawionych w tabeli 1 wynika również, że czas trwania poszczególnych etapów embriogenezy Asca-ris suum był także zróżnicowany w zależności od
gatun-ku grzyba, z którym ingatun-kubowano jaja. Największe różni-ce dotyczyły początku bruzdkowania (dwublastomerowe zarodki) i przekształcenia gastruli do larwy inwazyjnej.
W hodowlach kontrolnych rozwój gastrul do larw trwał 5 dni. Z Trichoderma viride i ze Stachybotrys chartarum ten etap embriogenezy trwał krócej i wynosił odpowiednio 3 i 4 dni. W jajach inkubowanych z pozostałymi gatunkami grzybów końcowy etap embriogenezy był wydłużony od 11 do 23 dni (tab. 1).
W obserwacjach mikroskopowych, w kolejnych eta-pach embriogenezy stwierdzono zaburzenia morfologicz-ne rozwijających się zarodków Ascaris suum w obecności wszystkich gatunków grzybów. W jajach kontrolnych zygota była kulista z równomiernie rozmieszczonym żółtkiem (ryc. 1). Natomiast w jajach inkubowanych z grzybami zygoty wykazywały wakuolizację, granulację i nierów-nomierne rozmieszczenie żółtka (ryc. 2). W jajach kon-trolnych Ascaris suum bruzdkowanie było równomierne (ryc. 3), podczas gdy w inkubowanych z grzybami, już po pierwszych podziałach blastomery różniły się wielkością (ryc. 4). Często w sąsiedztwie dzielących się blastome-rów występowały różnej wielkości przeźroczyste granu-le. W jajach pochodzących z hodowli kontrolnych morule i blastule złożone były z jednakowej wielkości komórek,
40 MAGDALENA JAbOROWSKA
podczas gdy w jajach inkubowanych z grzybami składa-ły się z blastomerów różnej wielkości. Gastrule w jajach kontrolnych miały charakterystyczną kijankopodobną budowę (ryc. 5), natomiast wśród jaj, które miały kontakt z grzybami, gastrule były zdeformowane, często z zatartą budową komórkową (ryc. 6). Larwy w jajach kontrolnych były ruchliwe i miały prawidłową budowę (ryc. 7), a w ja-jach hodowanych z grzybami często były w różnym stopniu zniekształcone (ryc. 8).
Częstość deformacji zarodkowych w jajach inkubowa-nych z grzybami pleśniowymi przedstawiono w tabeli 2.
Najmniejszy odsetek deformacji powodował Stachybotrys chartarum. Natomiast Penicillium frequentans i Metarhi-zium flavoviride wysoce destrukcyjnie oddziaływały na rozwój jaj glisty. W 60. dniu hodowli z tymi gatunkami, w ponad 70% jaj stwierdzono deformację zarodków. Dla porównania w hodowlach kontrolnych, w ostatnim dniu inkubacji odsetek jaj zdeformowanych wynosił tylko 5,3.
Są to różnice wysoce istotne statystycznie (p < 0,001).
W mikroskopie świetlnym nie stwierdzono penetra-cji grzybni badanych gatunków przez osłonki jajowe. Do 24. dnia inkubacji jaj z grzybami również w mikroskopie elektronowym skaningowym nie zaobserwowano zmian destrukcyjnych ich powierzchni. Jaja te nie różniły się od kontrolnych (ryc. 9). W hodowlach powyżej 24. dnia odno-towywano częściową lub całkowitą deformację powierzchni jaj (ryc. 10, 11, 12), ale nie zaobserwowano na apresorii i in-nych strukturach ułatwiających wnikanie strzępek grzybni do wnętrza jaj.
Martwe zarodki obserwowano w każdym z etapów embriogenezy, ale największą śmiertelność stwierdzo-no wśród rozwiniętych larw. W hodowlach kontrolnych, w ostatnim dniu doświadczenia jedynie 0,5% jaj zawierały martwe larwy (ryc. 13). Najwyższy odsetek (36%) larw martwych w 60. dniu inkubacji występował w hodowlach z Paecilomyces fumosoroseus, a najniższy ze Stachybotrys chartarum (2%). W porównaniu z kontrolą były to różnice istotne statystycznie.
Ryc. 1. Jajo Ascaris suum w stadium zygoty z hodowli kontrolnej (×1000)
Fig. 1. Zygote of Ascaris suum from control culture (1000×)
Ryc. 2. Jajo Ascaris suum w stadium zygoty z hodowli z Penicillium frequentans. Widoczna granulacja i wakuolizacja zarodka (×1000) Fig. 2. Granulation and vacuolization of Ascaris suum zygote cultured with
Penicillium frequentans (1000×)
Synergizm w oddziaływaniu wybranych gatunków grzybów pleśniowych na rozwój zarodkowy Ascaris suum stwierdzono pomiędzy Paecilomyces fumosoroseus i Metar-hizium flavoviride oraz Fusarium culmorum i Trichothecium roseum. W hodowlach z Fusarium culmorum i Trichothe-cium roseum jednocześnie, odsetek jaj z wadami rozwojo-wymi był wyższy niż w hodowlach z każdym z grzybów oddzielnie (tab. 2 i 3). W 60. dniu inkubacji w hodowlach z dwoma gatunkami grzybów zaobserwowano ok. 56%
jaj z wadami rozwojowymi. Jest to ponad 5% więcej jaj zdeformowanych niż w hodowlach Trichothecium roseum.
Różnica ta jest istotnie statystycznie (p < 0,05).
Na podstawie wyników przedstawionych w tabeli 4 wskazano, że badane mykotoksyny wykazały wysoce de-strukcyjne działanie na rozwój jaj Ascaris suum. Odsetek jaj z embriopatiami wzrastał wraz ze stężeniem mykotok-syn i czasem inkubacji. Wszystkie różnice w porównaniu z hodowlami kontrolnymi były wysoce istotne statystycznie (p < 0,001). Analizując dane z tabeli 4, należy stwierdzić, że w porównaniu z aflatoksyną wpływ ochratoksyny na powstanie wad rozwojowych był silniejszy. W 60. dniu inkubacji, w hodowlach z mykotoksynami (ochratoksyną A i aflatoksyną G1) odnotowano 100% śmiertelność larw inwazyjnych Ascaris suum.
Dyskusja
Wcześniejsze obserwacje innych autorów wskazywały, że spośród czynników biotycznych największą rolę w ograni-czaniu liczebności jaj geohelmintów odgrywają występujące powszechnie w glebie grzyby pleśniowe [2]. Badacze oceniali skuteczność antagonistycznego oddziaływania jedynie po-jedynczych gatunków grzybów. Na rozwój pasożytniczych geohelmintów nie badano dotąd wpływu grzybów z gatun-ków: Paecilomyces fumosoroseus, Metarhizium flavoviride, Metarhizium anisopliae, Trichothecium roseum, Aspergillus versicolor, Aspergillus niger i Trichoderma viride.
OGRANICZENIE LICZEBNOŚCI PASOŻYTNICZYCH GEOHELMINTÓW PRZEZ SAPROTROFICZNE GRZYBY GLEBOWE 41
Ryc. 3. Jajo Ascaris suum w stadium dwóch blastomerów z hodowli kontrolnej (×1000)
Fig. 3. Ascaris suum egg at the two-blastomere stage from control culture (1000×)
Ryc. 4. Jajo Ascaris suum z hodowli z Trichocladium asperum, (×1000)
Fig. 4. Ascaris suum egg incubated with Trichocladium asperum (1000×)
Ryc. 5. Jajo Ascaris suum w stadium gastruli z hodowli kontrolnej (×1000)
Fig. 5. Ascaris suum egg at the gastrula stage from control culture (1000×).
Ryc. 6. Zniekształcona gastrula w jaju Ascaris suum po inkubacji z Metarhizium anisopliae (×1000)
Fig. 6. Deformed gastrula in Ascaris suum egg incubated with Metarhizium anisopliae (1000×)
Ryc. 8. Jajo Ascaris suum z hodowli z Trichocladium asperum, zdeformowana larwa (×1000)
Fig. 8. Deformed larva in Ascaris suum egg cultured with Trichocladium asperum (1000×)
Ryc. 7. Jajo Ascaris suum w stadium larwy z hodowli kontrolnej (×1000)
Fig. 7. Ascaris suum egg at the larva stage from control culture (1000×)
42 MAGDALENA JAbOROWSKA
Ryc. 9. Powierzchnia jaja Ascaris suum z hodowli kontrolnej Fig. 9. The surface of Ascaris suum egg from control culture
Ryc. 10. Destrukcja powierzchni jaja Ascaris suum z 42-dniowej hodowli z Trichoderma viride
Fig. 10. Destruction of the surface of Ascaris suum egg from 42-day culture with Trichoderma viride
Ryc. 11. Zniszczone jajo Ascaris suum z 60-dniowej hodowli z Paecilomyces fumosoroseus
Fig. 11. Destroyed Ascaris suum egg from 60-day culture with Paecilomyces fumosoroseus
Ryc. 12. Całkowicie zniszczone jaja Ascaris suum z 60-dniowej hodowli z Penicillium frequentans
Fig. 12. Completely destroyed Ascaris suum eggs from 60-day culture with Penicillium frequentans
do powstawania larw inwazyjnych pod wpływem każdego z 11 badanych gatunków saprotroficznych grzybów glebo-wych. Tempo całej embriogenezy, jak i poszczególnych jej etapów, było zróżnicowane w zależności od gatunku grzyba.
Inni autorzy, jak Lýsek i Štĕrba [3], zaobserwowali również spowolnienie rozwoju embrionalnego Ascaris lumbrico-ides pod wpływem innego gatunku grzyba – Verticillium chlamydiosporum.
Wyniki badań własnych wskazują na dużą zmienność antagonistycznego oddziaływania saprotroficznych grzybów glebowych na rozwój jaj Ascaris suum. Wśród 11 badanych gatunków grzybów nie było nawet dwóch, których oddzia-ływanie byłoby porównywalne. Obserwacje te są zgodne z wynikami badań innych autorów. Basualdo i wsp. [4], oceniając wpływ Paecilomyces lilicinus i Paecilomyces maraquandii na rozwój embrionalny jaj Toxocara canis, wykazali, że P. lilicinus skuteczniej hamuje rozwój zarod-kowy tego nicienia, ponieważ już po 2 tygodniach hodowli uległo zniszczeniu ponad 80% jaj, podczas gdy P. maraqu-andii spowodował obumarcie ok. 23% jaj. Ciarmela i wsp.
[5] stwierdzili również istotne różnice w oddziaływaniu na
** p < 0,01; *** p < 0,001
Ryc. 13. Odsetek martwych larw Ascaris suum w hodowlach kontrolnych i doświadczalnych (60. dzień inkubacji)
Fig. 13. Percentage of dead larvae of Ascaris suum in the control and experimental cultures after 60 days of incubation
Na podstawie przeprowadzonych badań własnych wy-kazano opóźnienie rozwoju zarodkowego Ascaris suum, aż
OGRANICZENIE LICZEBNOŚCI PASOŻYTNICZYCH GEOHELMINTÓW PRZEZ SAPROTROFICZNE GRZYBY GLEBOWE 43
T a b e l a 2. Odsetek zdeformowanych zarodków Ascaris suum w hodowlach kontrolnych i doświadczalnych T a b l e 2. Percentage of deformed Ascaris suum embryos in control and experimental cultures
Dzień inkubacji / Day of incubation
Hodowla / Culture 3 7 14 28 60
Kontrolna / Control 0,1 0,7 2,2 2,9 5,3
Penicillium frequentans 1,9*** 4,9*** 29,5*** 43,1*** 72,5***
Paecilomyces fumosoroseus 1,1** 2,3** 4,5** 12,5*** 15,1***
Metarhizium flavoviride 1,1** 2,2** 6,2*** 52,7*** 75,2***
Metarhizium anisopliae 1,3** 7,6*** 10,1*** 16,1*** 40,0***
Trichothecium roseum 2,1*** 11,0*** 17,2*** 20,7*** 50,3***
Fusarium culmorum 2,2*** 16,4*** 18,1*** 19,7*** 53,7***
Aspergillus versicolor 3,7*** 8,3*** 15,8*** 16,0*** 30,8***
Aspergillus niger 14,1*** 26,3*** 32,3*** 42,7*** 66,3***
Trichocladium asperum 0,0 1,0 3,0 10,5*** 26,0***
Stachybotrys chartarum 0,0 2,0* 3,0 5,0* 7,0
Trichoderma viride 2,4*** 3,7*** 7,1*** 34,6*** 67,7***
* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001
T a b e l a 3. Odsetek zdeformowanych zarodków Ascaris suum inkubowanych jednocześnie z dwoma gatunkami grzybni T a b l e 3. Percentage of deformed Ascaris suum embryos incubated with two fungi species
Dzień inkubacji / Day of incubation
Hodowla / Culture 3 7 14 28 60
P. fumosoroseus + M. flavoviride 1,3 3,2 7,4 58,5 78,4
F. culmorum + T. roseum 2,1 16,5 18,8 23,8 55,9
T. asperum + S. chartarum 0,2 1,7 3,5 7,4 20,1
T a b e l a 4. Odsetek zdeformowanych zarodków Ascaris suum inkubowanych z ochratoksyną A i aflatoksyną G1 T a b l e 4. Percentage of deformed Ascaris suum embryos incubated with ochratoxin A or aflatoxin G1
Dzień inkubacji / Day of incubation
Hodowla / Culture 3 7 14 28 60
Kontrolna / Control 0,1 0,7 2,2 2,9 5,3
Ochratoksyna A Ochratoxin A
Stężenie Concentration
5*** 7*** 16*** 20*** 43***
0,5 ppm
1 ppm 8*** 16*** 25*** 36*** 71***
2 ppm 13*** 18*** 33*** 87*** 94***
Aflatoksyna G1 Aflatoxin G1
0,5 ppm 3*** 5*** 10*** 19*** 40***
1 ppm 4*** 9*** 14*** 40*** 63***
2 ppm 7*** 11*** 26*** 58*** 78***
*** p < 0,001
rozwój zarodkowy jaj Toxocara canis dwóch innych gatun-ków grzybów: Fusarium pallidoroseum i Mucor hiemalis, z których pierwszy spowodował zmiany morfologiczne w 84,3% jaj, a drugi jedynie w 14,5% jaj.
W pracy Kuźnej-Grygiel i wsp. [6] wykazano znaczne opóźnienie inicjacji podziału zygoty i spowolnienie rozwoju poszczególnych stadiów embriogenezy w jajach Ascaris suum inkubowanych z Penicillium frequentans i Stachy-botrys chartarum, przy czym antagonistyczny wpływ P. frequentans był znacznie silniejszy, ponieważ z tym gatunkiem grzyba embriogeneza była opóźniona o 19 dni, a ze S. chartarum tylko o 7 dni w porównaniu z kontrolą.
Dane te korespondują z wynikami przeprowadzonych badań własnych. Wykazały one bowiem nie tylko większe opóź-nienie rozwoju Ascaris suum pod wpływem Penicillium frequentans, ale przede wszystkim istotnie wyższy odsetek anomalii morfologicznych i śmiertelności larw.
W badaniach Jarnickiej-Stanios i Wawrzkiewicz [7]
rozwój zarodkowy Ascaris suum w obecności Fusarium sp.
był spowolniony o ponad 20 dni. W pracy jaja inkubowane z Fusarium culmorum miały tylko 8-dniowe opóźnienie całego rozwoju w porównaniu z kontrolnymi. Powyższe rozbieżności mogą być wynikiem różnic międzygatunko-wych w obrębie rodzaju Fusarium. Badane dwa gatunki
44 MAGDALENA JAbOROWSKA z rodzaju Metarhizium i dwa gatunki z rodzaju Aspergillus
nie hamowały również w jednakowym stopniu poszczegól-nych etapów rozwoju zarodkowego jaj Ascaris. W hodowli z Metarhizium flavoviride rozwój zygoty do wykształce-nia larwy inwazyjnej trwał 6 dni dłużej aniżeli z Metarhi-zium anisopliae. Podobnie, jaja Ascaris suum inkubowane z Aspergillus niger do rozwoju zygoty do larwy inwazyjnej potrzebowały o 7 dni więcej w porównaniu z jajami hodo-wanymi z Aspergillus versicolor. Każdy z dwóch gatun-ków Metarhizium i Aspergillus powodował istotne różnice statystyczne w odsetku wad rozwojowych i śmiertelności larw inwazyjnych.
Z badanych gatunków grzybów cały rozwój embrio-nalny Ascaris suum najbardziej spowalniał Trichocladium asperum. Znaczne zahamowanie tempa embriogenezy stwierdzono również w jajach pochodzących z hodowli z Paecilomyces fumosoroseus, Metarhizium flavoviride, Metarhizium anisopliae i Aspergillus niger. Rozwój jaj do larwy inwazyjnej w tych hodowlach doświadczalnych trwał ponad 40 dni.
W jajach inkubowanych ze wszystkimi badanymi gatunkami grzybów zaobserwowano wady morfologicz-ne zarodków, których odsetek wzrastał wraz z postępem embriogenezy. Ponieważ nie stwierdzono penetracji strzę-pek grzybni przez osłonki jajowe, należy sądzić, że na po-wstawanie tych embriopatii mogły mieć wpływ metabolity badanych grzybów. Granule różnej wielkości, które obser-wowano w sąsiedztwie dzielących się blastomerów, mogą wskazywać na przenikanie metabolitów grzybów przez osłonki jajowe. Podobne granule obserwowały Kołodziej-czyk i wsp. [8] w jajach Ascaris hodowanych w roztworze ochratoksyny A. Według Barrett [9], Clarke i Perry [10]
osłonki jaj nicieni są bardzo odpornymi strukturami, prze-puszczalnymi jedynie dla O2, CO2, wody i rozpuszczalnych lipidów. Są one trójwarstwowe i składają się z zewnętrznej warstwy białkowej, środkowej chitynowej i wewnętrznej lipidowej. Osłonki chitynowa i lipidowa są nieprzepusz-czalne dla większości związków rozpuszczalnych [11], przy czym najważniejszą rolę w ochronie zarodka odgrywa warstwa lipidowa [1, 12]. Można przypuszczać, że przez osłonki jajowe przechodzą te metabolity grzybów, które mają powinowactwo do lipidów, jak np. triacyglicerole, które wyizolowano z Fusarium oxysporum [13]. Wzrost częstości deformacji zarodków wraz z postępującym roz-wojem można wiązać z akumulacją metabolitów grzybo-wych z jednej strony, a z drugiej ze wzrostem aktywności obecnej w jajach chitynazy. Enzym ten jest niezbędny do rozpuszczania warstwy chitynowej podczas wykluwania się larwy. Jak wykazały badania Ward i Fairbairn [14], wzrost aktywności tego enzymu w jajach Ascaris suum następuje w końcowej fazie embriogenezy tego nicienia.
Dekompozycję osłonki chitynowej mogą powodować także grzyby cechujące się aktywnością chitynolityczną. Z grzybni Metarhizium anisopliae wyizolowano 6 różnych chitynaz, których rola w infekcji żywiciela jest jednak kontrowersyjna [15, 16, 17]. Kunert [18] nie wykazał korelacji pomiędzy
aktywnością chitynolityczną, lipolityczną i proteolityczną grzybów pleśniowych a penetracją strzępek do wnętrza jaj
aktywnością chitynolityczną, lipolityczną i proteolityczną grzybów pleśniowych a penetracją strzępek do wnętrza jaj