POJEDYNCZEGO NUKLEOTYDU Lidia Karabon
17.4. Ci˛ecie enzymatyczne - metoda Invader®
17.4. Ci˛ecie enzymatyczne - metoda Invader®
Najstarsz ˛a i najcz˛e´sciej u˙zywan ˛a metod ˛a genotypowania jest ci˛ecie enzymem restrykcyjnym (ang. restriction fragment length polymorphism, RLFP). Oznacza-nie wyst˛epowania poszczególnych alleli w danym miejscu polimorficznym opiera si˛e na wykorzystaniu własno´sci enzymów restrykcyjnych do egzonukleazowego ci˛ecia unikalnych sekwencji DNA rozpoznawanych przez dany enzym restryk-cyjny. Metod˛e t˛e stosuje si˛e tylko wówczas, gdy istnieje enzym rozpoznaj ˛acy sekwencj˛e wokół badanego SNP, który przecina sekwencj˛e w obecno´sci jednego allelu i zachowuje j ˛a w obecno´sci drugiego. Otrzymane po trawieniu enzymem fragmenty s ˛a separowane na ˙zelu agarozowym. Na podstawie analizy długo´sci fragmentów okre´sla si˛e, czy zaszło trawienie enzymem, co oznacza, ˙ze wyst ˛apił jeden z alleli, czy te˙z nie nast ˛apiło ci˛ecie, co ´swiadczy o obecno´sci drugiego al-lelu.
Zastosowanie tej metody jest ograniczone tylko do tych miejsc polimorficz-nych, dla których mo˙zna znale´z´c odpowiednie enzymy restrykcyjne. Ponadto jest to metoda dosy´c pracochłonna i nie nadaje si˛e do bada ´n na du˙z ˛a skal˛e.
Rozwi ˛azaniem wykorzystuj ˛acym ci˛ecie enzymatyczne, ale pozbawionym
ogranicze ´n metody RFLP jest metoda Invader®. W te´scie Invader® zastosowano sondy nakładaj ˛ace si˛e na miejsce polimorficzne i enzym, który specyficznie roz-poznaje powstaj ˛ac ˛a „zakładk˛e” [12].
W metodzie tej u˙zywa si˛e dwóch oligonukleotydów, które hybrydyzuj ˛a do da-nego regionu zawieraj ˛acego SNP. Jeden oligonukleotyd (oligo Invader®) jest kom-plementarny do sekwencji 3’ regionu obejmuj ˛acego SNP i ko ´nczy si˛e zasad ˛a nie pasuj ˛ac ˛a (nie komplementarn ˛a) do SNP nakładaj ˛ac ˛a si˛e na t˛e zasad˛e. Drugi oli-gonukleotyd, sonda specyficzna dla danego allelu, która z jednej strony jest kom-plementarna do 5’ regionu SNP, natomiast z drugiej wydłu˙zona niekomplemen-tarnie o kilka zasad. Przył ˛aczenie si˛e obu oligonukleotydów do badanej sekwen-cji DNA powoduje utworzenie trójwymiarowej struktury przestrzennej nad ba-danym SNP rozpoznawanej i przecinanej przez enzym FEN (ang. flap endonucle-ase) [13]. W celu detekcji okre´slonych alleli stosuje si˛e opisan ˛a w poprzednim rozdziale technik˛e FRET, tzn. na 5’ ko ´ncu sonda zawiera fluorochrom, a na 3’ ko ´ncu wygaszacz. Po odci˛eciu 5’ ko ´nca sondy przez enzym FEN, uwolniony frag-ment zawieraj ˛acy fluorochrom oddala si˛e od wygaszacza i zaczyna ´swieci´c. Je˙zeli sonda „nie pasuje” do danego allelu nie tworzy si˛e przestrzenna struktura rozpo-znawana przez FEN i reakcja nie zachodzi (Rycina 17.6). Ta metoda jest wysoce specyficzna i przy nie dopasowanej sondzie nie zachodzi nawet minimalne ci˛e-cie.
Zazwyczaj oligo Invader® jest tak zaprojektowany, ˙zeby był na stałe przył ˛ a-czony do badanego regionu DNA, natomiast sonda ma temperatur˛e topnienia zgodn ˛a z temperatur ˛a, w jakiej przeprowadza si˛e test, co sprawia, ˙ze sonda przy-ł ˛acza si˛e i odł ˛acza. W czasie przył ˛aczenia enzym przecina oligonukleotyd, pozo-stały fragment sondy odrywa si˛e, a kolejna sonda mo˙ze si˛e przył ˛aczy´c do bada-nego miejsca. Metoda zapewnia wysok ˛a specyficzno´s´c genotypowania, ale wy-maga wst˛epnego powielenia badanego fragmentu DNA, a ponadto konieczne jest 177
17. Genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu
Q
Zak³adka Invader oligo
Docelowa sekwencja DNA- allel T Sonda 1 F1 A c g t c a g N g t c T g c a 5’ 5’ 3’ 3’ c a g N g t c T g c a 5’ 5’ 3’ c g t 3’ C Invader oligo Zak³adka Q 5’
Docelowa sekwencja DNA- allel T Sonda 2 F1
Brak ciêcia F1
F1 Znacznik fluorescencyjny Q Wygaszacz
5’
Miejsce ciêcia
Rycina 17.6: Metoda Invader®. Oligo Invader (komplementarny do sekwencji 3’ regionu obejmuj ˛acego SNP i ko ´nczy si˛e zasad ˛a nie pasuj ˛ac ˛a i nakładaj ˛ac ˛a si˛e na t˛e zasad˛e) przył ˛ a-cza si˛e do sekwencji docelowej. Sonda specyficzna dla danego allelu, z jednej strony jest komplementarna do 5’ regionu SNP, ale z drugiej strony jest wydłu˙zona niekomplemen-tarnie o kilka zasad. Przył ˛aczenie si˛e sondy i oligo Invader do badanej sekwencji DNA powoduje utworzenie trójwymiarowej struktury przestrzennej nad badanym SNP rozpo-znawanej i przecinanej przez enzym FEN. W celu detekcji okre´slonych alleli stosuje si˛e technik˛e FRET: na 5’ ko ´ncu sonda zawiera fluorochrom, a na 3’ ko ´ncu wygaszacz. Po odci˛eciu 5’ ko ´nca sondy przez enzym FEN, uwolniony fragment zawieraj ˛acy fluorochrom oddala si˛e od wygaszacza i zaczyna ´swieci´c. Je˙zeli sonda „nie pasuje” do danego allelu nie tworzy si˛e przestrzenna struktura rozpoznawana przez FEN i reakcja nie zachodzi (mo-dyfikowane wg [12]).
zastosowanie dwóch znakowanych sond, specyficznych do ka˙zdego z alleli, co zwi˛eksza koszty typowania.
Hall i wsp. [14] staraj ˛ac si˛e zredukowa´c ograniczenia tej metody zastosowali szereg modyfikacji, co doprowadziło do wynalezienia metody Biplex Invader®, inaczej nazywan ˛a SISAR (ang. seria invasive signal amplification reaction). Me-toda Biplex Invader® oparta jest na dwuetapowym te´scie. W pierwszym etapie, podobnie jak w opisanej powy˙zej reakcji Invader®, dwa oligonukleotydy kom-plementarne do docelowej sekwencji przył ˛aczaj ˛a si˛e do regionu obejmuj ˛acego badane SNP. Jednak˙ze, inaczej ni˙z poprzednio, sondy nie s ˛a znakowane fluore-scencyjnie, natomiast ich 5’ ko ´nce s ˛a dodatkowo wydłu˙zone o nie komplemen-tarny do sekwencji fragment. Te fragmenty sond nazywane „zakładk ˛a” (flap), s ˛a inne dla ka˙zdej z dwóch sond, i nie przył ˛aczaj ˛a si˛e do badanego DNA. Je˙zeli sonda pasuje do danego allelu, to po przył ˛aczeniu si˛e oligo Invader® i sondy, po-wstaje przestrzenna trójwymiarowa struktura rozpoznawana przez enzym FEN i „zakładka” powi˛ekszona o nukleotyd komplementarny do allelu znajduj ˛acego si˛e w badanym miejscu polimorficznym jest odcinana. Poniewa˙z „zakładki” s ˛a niezale˙zne od badanego regionu, w nast˛epnym etapie testu u˙zywa si˛e dwóch
17.4. Ci˛ecie enzymatyczne - metoda Invader®
Zak³adka 1 Invader oligo
Docelowa sekwencja DNA- allel T Sonda 1 A c g t c a g N g t c T g c a 5’ 5’ 3’ 3’ c a g N g t c T g c a 5’ 5’ 3’ c g t 3’ C Invader oligo Zak³adka 2 5’
Docelowa sekwencja DNA- allel T Sonda 2
F1
F1 Znacznik fluorescencyjny Q Wygaszacz
5’ Miejsce ciêcia A F1 Q 5’ 5’ 3’
Kaseta FRET 1 Kaseta FRET 2
F2 Q
5’ 3’ 1
Rycina 17.7: Metoda Biplex Invader®. W pierwszym etapie oligo Invader i sonda przy-ł ˛aczaj ˛a si˛e do regionu SNP. 5’ Koniec sondy jest wydłu˙zony i nie jest komplementany do sekwencji, nie przył ˛acza si˛e do badanego DNA tylko tworzy „zakładk˛e” (flap). „Zakładka” dla ka˙zdej z dwóch sond jest inna. Je˙zeli sonda pasuje do danego allelu, to po przył ˛ acze-niu oligo Invader® i sondy nast˛epuje ci˛ecie, „Zakładka” powi˛ekszona o nukleotyd kom-plementarny do allelu SNP jest odcinana. W nast˛epnym etapie u˙zywa si˛e dwóch „kaset FRET”, ka˙zdej pasuj ˛acej do 3’ ko ´nca innej zakładki. Kaseta FRET zawiera równie˙z odpo-wiedni fluorochrom oraz wygaszacz na 5’ ko ´ncu. Po przył ˛aczeniu „zakładki” do kasety FRET powstaje miejsce ci˛ecia enzymem FEN. Trawienie oddala fluorochrom od wygasza-cza i emitowana jest wła´sciwa fluorescencja (zmodyfikowane wg [12]).
„kaset FRET”, ka˙zdej pasuj ˛acej do innej „zakładki”. Kaseta FRET zawiera na 3’ ko ´ncu sekwencj˛e pasuj ˛ac ˛a do danej „zakładki”, a odpowiedni fluorochrom oraz wygaszacz na 5’ko ´ncu. Po zwi ˛azaniu si˛e „zakładki” z kaset ˛a FRET powstaje znów struktura przestrzenna rozpoznawana przez enzym FEN, przy czym miejsce ci˛e-cia znajduje si˛e przed wygaszaczem. Trawienie enzymem oddala fluorochrom od wygaszacza i emitowana jest fluorescencja (Rycina 17.7).
Otrzymany z czytnika fluorescencji wynik jest analogiczny do obrazu wyników otrzymywanych w metodzie z zastosowaniem sond TaqMan (Rycina 17.1).
Ta technika ma szereg zalet w stosunku do poprzedniej. Test jest wielokrot-nie bardziej czuły i pozwala na genotypowawielokrot-nie bez kowielokrot-nieczno´sci wcze´swielokrot-niejszej amplifikacji DNA. Sondy nie s ˛a znakowane fluorescencyjnie, co powoduje obni-˙zenie kosztów. Dodatkowo u˙zywane w tej metodzie „zakładki” s ˛a uniwersalne
i pasuj ˛a do odpowiednich komercyjnych kaset FRET. Zastosowanie kaset FRET
jest mniej kosztowne, poniewa˙z ze wzgl˛edu na swoj ˛a uniwersalno´s´c mog ˛a by´c produkowane na szerok ˛a skal˛e.
17. Genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu
17.5. Podsumowanie
Ka˙zda z opisanych powy˙zej metod mo˙ze by´c stosowana do oznaczania wielu próbek jednocze´snie tzn. na 96-dołkowej płytce. Wszystkie metody maj ˛a po-dobn ˛a powtarzalno´s´c, zbli˙zony odsetek bł˛edów i niejednoznacznych wyników [15]. Natomiast ka˙zda z nich ma okre´slone zalety i ograniczenia.
Metoda z zastosowaniem sond TaqMan jest prosta i szybka - ok. 2 h, (przy-gotowanie reakcji PCR na 96 próbek trwa ok. 0.5 h, reakcja PCR ok. 1,5 h, odczyt fluorescencji przed i po reakcji ok. 5 minut). Metoda jest czuła i nie wymaga wy-sokich st˛e˙ze ´n DNA (15 ng DNA na reakcj˛e), a ponadto charakteryzuje si˛e stosun-kowo mał ˛a liczb ˛a wyników niejednoznacznych. Do zalet nale˙zy równie˙z zaliczy´c stale rosn ˛ac ˛a liczb˛e komercyjnie dost˛epnych, zwalidowanych i zoptymalizowa-nych testów np. firmy Life Technologies. Mankamentem jest stosunkowo wysoka cena za jedno oznaczenie i konieczno´s´c posiadania aparatu do real-time PCR.
Najwi˛eksz ˛a zalet ˛a metody SNaPshot® jest mo˙zliwo´s´c oznaczania od kilku na-wet do dziesi˛eciu SNP równocze´snie. Takie podej´scie wymaga jednak
praco-chłonnej optymalizacji, któr ˛a badacz musi wykona´c przed przeprowadzeniem
testu. Sama procedura jest ponadto wieloetapowa i czasochłonna. Metoda wy-maga wcze´sniejszej amplifikacji badanego fragmentu (ok. 2 h), oczyszczenia pro-duktów po pierwszym PCR przy u˙zyciu enzymów Exo -SAP - (ok 1 h), nast˛epnie przeprowadzenia reakcji snapowania (ok. 2 h z przygotowaniem reakcji), kolej-nego oczyszczania po drugim PCR (1 h), a nast˛epnie elektroforezy kapilarnej w analizatorze genetycznym - ok. 6 h. Dodatkowym utrudnieniem jest konieczno´s´c posiadania drogiego wyposa˙zenia, jakim jest sekwenator ABI PRISM®, Genetic Analyzer (PE Biosystems).
Niew ˛atpliw ˛a zalet˛e metody Biplex Invader® stanowi brak etapu powielania materiału do bada ´n. Równie korzystna jest stosunkowo niska cena jednego ozna-czenia. Dodatkowym atutem jest mo˙zliwo´s´c przeprowadzenia typowania bez ko-nieczno´sci u˙zycia specjalistycznego sprz˛etu - do odczytu konieczny jest jedynie czytnik fluorescencji. W artykule Pati i wsp. [15] stwierdzono, ˙ze w´sród trzech po-równywanych metod: SNaPshot®, Pyrosequencing® i Biplex Invader®, ta ostat-nia charakteryzowała si˛e najwi˛eksz ˛a dokładno´sci ˛a i najni˙zszym kosztem poje-dynczego genotypowania. Niestety w Polsce jest to mało popularna metoda, co wynika prawdopodobnie z braku na krajowym rynku przedstawiciela firmy Third Wave Technologies b˛ed ˛acej wła´scicielem patentu na t˛e metod˛e.
Literatura
[1] Risch N.J. Searching for genetic determinants in the new millennium, Nature, 2000 15; 405(6788): 847-56
[2] Taylor J.G., Choi E.H., Foster C.B., Chanock S.J. Using genetic variation to study hu-man disease, Trends Mol Med. 2001; 7(11): 507-12
[3] Gray I.C., Campbell D.A., Spurr N.K. Single nucleotide polymorphisms as tools in human genetics. Hum Mol Genet. 2000; 9(16):2403-8
[4] Twyman R.M., Single Nucleotide Polymorphism (SNP) genotyping Techniques- an overview, Encyclopedia of Diagnostics of Genomics and Proteomics, 2005 by Marcell
17.5. Podsumowanie Dekker, 1202-1207
[5] Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids Res 1993; 21: 3761-3766
[6] Livak K.J., Flood S.J.A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K. Oligonucleotides with fluore-scent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Meth Appl 1995; 4: 357–362 [7] Afonina I.A., Reed M.W., Lusby E., Shishkina I.G., Belousov Y.S. Minor groove
binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence. Biotechniques 2002; 32: 940–9
[8] Product bulletin, TaqMan® SNP Genotyping Assays, Life Technologies
[9] Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibi-tors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463-7
[10] Product bulletin, SNaPshot® SNP AnalysisSNaPshot® Multiplex System for SNP ge-notyping, One system, many applications, AppliedBiosystems by Life Technologist [11] Product bulletin, SNaPshot® Multiplex System, AppliedBiosystems by Life
Techno-logist
[12] Olivier M. The Invader® assay for SNP genotyping. Mutat Res. 2005,3;573: 103-10 [13] Lyamichev V., Mast A.L., Hall J.G., Prudent J.R., Kaiser M.W., Takova T.,
Kwiatkow-ski R.W., Sander T.J., de Arruda M., Arco D.A., Neri B.P., Brow M.A. Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide probes, Nat Biotechnol. 1999;17(3): 292-6
[14] Hall J.G., Eis P.S., Law S.M., Reynaldo L.P., Prudent J.R., Marshall D.J., Allawi H.T., Mast A.L., Dahlberg J.E., Kwiatkowski R.W., de Arruda M., Neri B.P., Lyamichev V.I. Sensitive detection of DNA polymorphisms by the serial invasive signal amplification reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(15): 8272-7
[15] Pati N., Schowinsky V., Kokanovic O., Magnuson V., Ghosh S. A comparison between SNaPshot, pyrosequencing, and biplex Invader® SNP genotyping methods: accu-racy, cost, and throughput. J Biochem Biophys Methods. 2004 30;60(1): 1-12
R O Z D Z I A Ł