Procedury diagnostyki cytogenetycznej w hematoonkologii

Wykrycie i okre´slenie składu zaburze ´n kariotypowych, poparte badaniami z zastosowaniem metod cytogenetyki molekularnej, pozwala specjali´scie na okre-´slenie rodzaju genetycznych aberracji wyst˛epuj ˛acych w badanych komórkach nowotworowych. Zaburzenie fizjologicznej czynno´sci komórek szpiku w wy-niku specyficznych translokacji, jest ´zródłem powstawania wielu typów biała-czek, w których powstanie okre´slonych genów fuzyjnych powoduje zaburzenie funkcjonowania odpowiednich szlaków metabolicznych (Tabela 13.1).

Poznanie genetycznych mechanizmów powstawania nowotworu zapocz ˛

atko-wało okre´slenie translokacji t(9;22), jako zmiany zwi ˛azanej z przewlekł ˛a białaczk ˛a szpikow ˛a (ang. chronic myeloid leukemia, CML). Jej odkrycie było pierwsz ˛a ob-serwacj ˛a zwi ˛azku mi˛edzy specyficzn ˛a zmian ˛a chromosomow ˛a a okre´slonym ty-pem nowotworu [8]. Miejscami p˛ekni˛e´c w przypadku tej translokacji s ˛a: w chro-mosomie 9 region obejmuj ˛acy gen ABL (pr ˛a˙zek q34) i w chromosomie 22 region genu BCR (pr ˛a˙zek q11). Rezultatem translokacji wzajemnej jest utworzenie fu-zyjnego genu BCR/ABL, którego produkt: patogenne białko p210^bcr-abl (wyj ˛ at-kowo 190^bcr-abllub 230^bcr-abl), wykazuje podwy˙zszon ˛a aktywno´s´c kinazy tyrozy-nowej [9, 10]. Zjawiska te s ˛a przyczyna powstania klinicznego obrazu przewlekłej białaczki szpikowej.

Niekiedy ta sama aberracja wyst˛epuje w ró˙znych typach rozrostów, powodu-j ˛ac odmienne skutki biologiczne. Translokacja t(9;22)(q34;q11), wykrywana jest tak˙ze u ok. 10-30% pacjentów z ostr ˛a białaczk ˛a limfoblastyczn ˛a (ang. acute lym-phoblastic leukemia, ALL) jako zmiana wtórna, wskazuj ˛aca na niekorzystna pro-gnoz˛e [11]. A zatem, oprócz stwierdzenia faktu obecno´sci aberracji w komórkach nowotworu i odsetka komórek ze zmian ˛a, niezmiernie istotna jest prawidłowa in-terpretacja uzyskanych danych w kontek´scie klinicznym. Inin-terpretacja, dokony-wana na podstawie współczesnej wiedzy i w oparciu o obowi ˛azuj ˛ace zasady dia-gnostyczne, ocenia mo˙zliwe skutki kliniczne takich nieprawidłowo´sci i ma pod-stawowe znaczenie w rozpoznawaniu, a cz˛esto tak˙ze w prognozowaniu przebiegu i planowaniu terapii białaczek i chłoniaków [12–16].

13.4. Procedury diagnostyki cytogenetycznej w hematoonkologii Tabela 13.1: Typowe aberracje chromosomowe w wybranych białaczkach.

Typ rozrostu nowotworowego Aberracja Zaburzenie genowe Znaczenie kliniczne Przewlekła białaczka szpikowa t(9;22)(q34;q11) fuzja BCR/ABL

diagnostyczne, wskazanie do lecze-nia inhibitorami kinaz, monitoro-wanie leczenia;

i(17), +Ph zmiany wtórne pogarszaj ˛ace roko-wanie

Ostra białaczka limfoblastyczna

t(9;22)(q34;q11) czynnik złego rokowania Przewlekła białaczka neutrofilowa 10% z aberracjami cytogenet. Zmiany niespecyficzne: +8, +9, +21, del(20q), del(11q), del(12p) –

BRAK t(9;22) BCR/ABL obecno´s´c fuzji BCR/ABL wyklucza diagnoz˛e,

obecno´s´c fuzji wskazuje na niety-pow ˛a CML z p230

Czerwienica prawdziwa

20% z aberracjami cytogenet. Zmiany niespecyficzne: +8, +9, del(20q), del(13q), del(9p)

niemal wszystkie przypadki z aber-racjami rozwijaj ˛a MDS/AML; BRAK t(9;22) BCR/ABL

w progresji: >95% mutacja JAK2

obecno´s´c fuzji BCR/ABL wyklucza diagnoz˛e; Nadpłytkowo´s´c samoistna 5-10% z aberracjami Zmiany niespecyficzne: +8, 5q-, del(9q), 20q-,

je´sli widoczne 5q- nale˙zy ró˙znico-wa´c z MDS

BRAK t(9;22) BCR/ABL obecno´s´c fuzji BCR/ABL wyklucza diagnoz˛e Przewlekła białaczka eozynofilowa del(4)(q12)* fuzja FIP1L1/PDGFRA

diagnostyczne, wskazanie do lecze-nia inhibitorami kinaz

Ostra białaczka szpikowa z t(15;17)

t(15;17)(q22;q12) fuzja PML/RARA

diagnostyczne, dobre rokowanie, wskazanie do leczenia ATRA Ostra białaczka

szpikowa z t(8;21)

t(8;21)(q22;q22) fuzja RUNX1/RUNX1T1 (AML1/ETO)

diagnostyczne, dobre rokowanie; tylko mutacja KIT pogarsza roko-wanie Ostra białaczka szpikowa z t(6;9)(p23;q34) t(6;9)(p23;q34)* fuzja DEK/NUP214(CAN)

diagnostyczne, złe rokowanie

*niewidoczne (lub trudne do uchwycenia) w badaniu kariotypowym

W diagnostyce hematoonkologicznej cytogenetyczne metody diagnostyczne stosowane s ˛a zwykle równolegle, poniewa˙z ekspertyza uzyskana przy u˙zyciu jed-141

13. Badania technikami cytogenetyki klasycznej ...

nej z nich mo˙ze by´c niewystarczaj ˛aca lub niepełna. Precyzyjna ocena statusu

wybranych genów w technice FISH nie mówi nic o ewentualnie istniej ˛acych

w komórce innych aberracjach, za´s cało´sciowa informacja uzyskana podczas ka-riotypowania jest znacznie mniej szczegółowa ze wzgl˛edu na stosunkowo nisk ˛a rozdzielczo´s´c metody. Szczególnie w przypadku diagnozy ró˙znicowej b ˛ad´z nie-pewno´sci co do rozpoznania, dopiero uzupełniaj ˛ace si˛e wyniki kariotypowania i-FISH pozwalaj ˛a na uzyskanie miarodajnej opinii. W okre´slonych rozrostach he-matologicznych zaakceptowano okre´slony tryb post˛epowania diagnostycznego, gdzie obecno´s´c (lub brak) okre´slonej aberracji w podstawowym badaniu kario-typu obliguje diagnost˛e do poszukiwa ´n okre´slonych aberracji metod ˛a FISH [17]. 13.4.1. Przykładowa diagnostyka

Diagnoza przewlekłej białaczki szpikowej wymaga potwierdzenia obecno-´sci specyficznej translokacji t(9;22)(q34q11) w badaniu kariotypu (cytogene-tyka klasyczna), gdzie wyró˙znia si˛e nieprawidłowe kopie chromosomów 9 i 22 (Rycina 13.1). Fuzj˛e genow ˛a BCR/ABL ujawnia si˛e w badaniu technik ˛a FISH (Rycina 13.2A), a patognomoniczny produkt białkowy - w badaniu zró˙znicowa-nymi technikami PCR (ang. polymerase chain reaction). Wykazanie obecno´sci tych zmian potwierdza diagnoz˛e przewlekłej białaczki szpikowej, za´s ich brak – definitywnie wyklucza rozpoznanie CML (Rycina 13.3).

KARIOTYP

Analiza metafaz 20-30

BRAK METAFAZ

t(9;22) _BCR/ABL+^i-FISH _BCR/ABL-^FISH

FISH BCR/ABL-FISH BCR/ABL+ WYNIK: nie-CML WYNIK: CML

WDRO¯ENIE LECZENIA ITK

Brak t(9;22) nietypowe zmiany

Rycina 13.3: Schemat analizy cytogenetycznej w przewlekłej białaczce szpikowej.

Typow ˛a translokacj˛e t(9;22)(q34q11) lub jej warianty wykrywa si˛e w badaniu kariotypowym u około 90% pacjentów z CML. Je´sli jednak nie uzyska si˛e meta-faz lub je´sli nie stwierdzi si˛e obecno´sci oczekiwanej aberracji – konieczne jest uzupełnienie oceny technik ˛a FISH z sond ˛a znakuj ˛aca geny BCR i ABL. Bada-nie FISH jednoznaczBada-nie wykrywa obecno´s´c genu fuzyjnego. W komórkach bia-łaczkowych znakowanie BCR/ABL+ ujawnia si˛e zarówno w j ˛adrach interfazowych (i-FISH) jak i w metafazach z nietypowymi aberracjami, prowadz ˛acymi do

ukry-13.5. Podsumowanie tej (niewidocznej w kariotypie) fuzji genowej. Fuzja (BCR/ABL+), w przypadkach CML z brakiem translokacji t(9;22), powstaje zwykle w wyniku insercji genu ABL w pobli˙ze genu BCR na chromosomie 22. Wówczas to, pozornie morfologicznie normalny chromosomom 22 produkuje chimeryczne białko BCR/ABL.

W diagnostyce przewlekłej białaczki szpikowej nale˙zy jednak d ˛a˙zy´c do pełnej oceny kariotypu, która pozwalaja na równoczesne wykrycie ewentualnych zmian wtórnych. Oznaczona w trakcie diagnostyki cytogenetycznej aberracja pierwotna jest te˙z indykatorem przebiegu choroby i odpowiedzi na leczenie. Odsetek komó-rek z translokacj ˛a (9;22) lub fuzj ˛a BCR/ABL okre´sla stopie ´n remisji cytogenetycz-nej, obligatoryjnie oznaczany w trakcie leczenia.

Genetyczne zdefiniowanie choroby nowotworowej jest niezb˛edne w przy-padku stosowania nowej strategii leczenia: terapii celowanej. Leczenie celowane to farmakologiczne oddziaływanie na cele cz ˛asteczkowe, maj ˛ace zasadnicz ˛a rol˛e w powstawaniu i rozwoju danego nowotworu. Lek molekularnie celowany ata-kuje wybiórczo komórki nowotworu, nie powoduj ˛ac uszkodze ´n komórek prawi-dłowych. Pierwszym skutecznym lekiem tej grupy był Imatinib (inne nazwy Gli-vec, Gleevec),inhibitor kinazy tyrozynowej, stosowany dzi´s powszechnie w lecze-niu pacjentów z przewlekł ˛a białaczk ˛a szpikow ˛a. Zatem brak celu komórkowego (nieprawidłowego białka BCR/ABL) w przypadku zastosowania ITK w nie-CML skutkowa´c b˛edzie niepowodzeniem leczenia. Detekcja obecno´sci translokacji t(9;22)(q34;q11) z fuzj ˛a BCR/ABL1 jest wi˛ec nie tylko niezb˛ednym warunkiem pra-widłowej diagnozy, ale te˙z warunkiem wdro˙zenia skutecznego leczenia [18].

13.5. Podsumowanie

Wykrycie i okre´slenie składu aberracji kariotypowych, poparte

zdefiniowa-niem zaburze ´n genowych metodami cytogenetyki molekularnej, pozwala na

okre´slenie rodzaju genetycznych zmian wyst˛epuj ˛acych w badanych komórkach nowotworu. Informacja ta ma podstawowe znaczenie w diagnostyce wi˛ekszo´sci białaczek i chłoniaków. Optymalizacja procedur stosowanych w laboratoriach cy-togenetycznych ma zatem w hematoonkologii kluczowe znaczenie dla powodze-nia leczepowodze-nia.

Literatura

[1] Sverdlow S.H., Campo E., Harris N.L. i wsp. (red.): WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press, Lyon, 2008.

[2] Tjio J.H., Levan A.: The chromosome number of man. Hereditas. (42), 1956: 1-6 [3] Schaffer L.G., Slovak M.L, Campbell L.J (eds): ISCN. An International System for

Hu-man Cytogenetic Nomenclature. Karger, Basel, 2009

[4] Wang H.C., Fedoroff S.: Banding in human chromosomes treated with trypsin. Na-ture New Biol. (235), 1972: 52-54

[5] E.C.A. Permanent Working Group for Cytogenetics Society, Acess July 2012.

http://www.eurogentest.org/web/info/public/unit1/guidelines/ cytogenetics/index.xhtml

13. Badania technikami cytogenetyki klasycznej ...

[6] Pie ´nkowska-Grela B. (red): Analiza cytogenetyczna w nowotworach hematoonkolo-gicznych. Poradnik. Sekcja Cytogenetyki Hematoonkologicznej PTGC, Warszawa 2004

[7] Pinkel D., Straume T., Gray J.W.: Cytogenetic analysis using quantitative high sensitivi-ty, fluorescence hybridization. Proc Natl Acad Sci USA (83), 1986: 2934-2938 [8] Nowell P.C., Hungerford D.A.: A minute chromosome in human granulocytic

leuke-mia. Science 1960; 132: 1497

[9] Rowley J.D.: The critical role of chromosome translocations in human leukemias. Annu Rev Genet 1998; 32: 495-519

[10] Heisterkamp N., Groffen J.: Molecular insights into the Philadelphia translocation. He-matol Pathol. 1991; 5(1): 1-10

[11] Heerema N.A., Harbott J., Galimberti S. i wsp.: Secondary cytogenetic aberrations in childhood Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia are nonrandom and may be associated with outcome. Leukemia, 2004; 18: 693-702 [12] Dwilewicz-Trojaczek J., Deptała A., Hellmann A., M ˛adry K., Podolak-Dawidziak M.,

Warzocha K.: Diagnostyka, klasyfikacja i leczenie zespołów mielodysplastycznych: zalece-nia ekspertów polskich. Acta Haematol. Pol. (41), 2010: 101-114

[13] Hołowiecki J.: Nowotwory z limfoidalnych komórek prekursorowych. Ostre białaczki limfoblastyczne w Krzakowski M. (red). Zalecenia post˛epowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach zło´sliwych. Via Medica,Warszawa, 2009

[14] Gał ˛azka K., Mioduszewska O., Maryniak R., Ziarkiewicz-Wróblewska B., Rymkiewicz G., Pie ´nkowska-Grela B. i wsp: Podstawowe zasady i organizacja diagnostyki patolo-gicznej chłoniaków. Polish Journal Pathology, 58(3), 2007: 1-14

[15] Hołowiecki J.: Ostre białaczki szpikowe (Polska Grupa ds. Leczenia Białaczek u Do-rosłych — PALG). Zalecenia post˛epowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowo-tworach zło´sliwych, 2009

[16] Preizner W., Sacha T., Salamanczuk Z., Pie ´nkowska-Grela B., Haus O., Hellmann A.: Standard post˛epowania diagnostycznego i terapeutycznego u chorych z przewlekł ˛a białacz-ka szpikow ˛a w Polsce. Acta Hematologica Polonica (30), 2008: 107-122 [17] Haferlach C., Rieder H., Lillington D.M., Dastugue N., Hagemaijer A., Harbott J.

i wsp.: Proposal for standarization protocols for cytogenetic analyses of AML, CLL, CML CMD i MDS, Genes Chromosom Cancer 2007, 46: 494-499

[18] Recommendations European LeukemiaNet for the Management of CML. Update2010.http://www.eutos.org/content/home/news/download_material/ e1023/infoboxCon-tent1024/PocketCard_2010_final.pdf

R O