Oznaczanie chimeryzmu

15.2. Oznaczanie chimeryzmu

Oznaczanie chimeryzmu pozwala stwierdzi´c i udokumentowa´c przyj˛ecie si˛e przeszczepionego materiału b ˛ad´z jego odrzucenie. Badaj ˛ac chimeryzm poprzeszczepowy wielokrotnie po transplantacji mo˙zna uchwyci´c ewentualne zmiany oraz monitorowa´c ich dynamik˛e. Wysoka czuło´s´c tej metody umo˙zliwia zdiagnozowanie wznowy choroby wcze´sniej ni˙z inne metody.

Analiza chimeryzmu mo˙ze równie˙z by´c pomocna w ocenie ryzyka wyst ˛ apie-nia choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (ang. graft versus host disease, GvHD). Szczególnie istotne jest tutaj przeprowadzenie badania w populacji

lim-focytów T. Po˙z ˛adany stan pełnego chimeryzmu, w przypadku komórek T, jest

zwi ˛azany z wi˛ekszym ryzykiem choroby GvH [3]. Mieszany chimeryzm ´swiadczy o pewnej tolerancji immunologicznej pomi˛edzy komórkami dawcy i komórkami biorcy i jest zwi ˛azany z mniejszym prawdopodobie ´nstwem wyst ˛apienia GvHD. Brak reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi wi ˛a˙ze si˛e jednak z brakiem re-akcji przeszczep przeciwko białaczce (ang. graft versus leukaemia, GvL) co nie jest korzystne w przypadku pacjentów przeszczepionych z powodu choroby roz-rostowej.

Badanie chimeryzmu poprzeszczepowego w populacji limfocytów B ma zna-czenie u pacjentów z ostr ˛a białaczk ˛a limfoblastyczn ˛a z komórek B. Pojawienie si˛e mieszanego chimeryzmu mo˙ze w tym przypadku ´swiadczy´c o mo˙zliwo´sci wznowy choroby podstawowej.

Odr˛ebn ˛a grup ˛a chorych, s ˛a dzieci, u których dokonano zabiegu przeszcze-pienia komórek krwiotwórczych z powodu wrodzonego niedoboru odporno´sci (ang. severe combined immunodeficiencies, SCID). Badanie chimeryzmu w sub-populacjach komórkowych (T, B, NK etc.) daje informacje o tym, czy uzupełniony został ubytek poszczególnych linii komórkowych.

15.3. Metoda

Obecnie, do badania chimeryzmu poprzeszczepowego, najcz˛e´sciej stosuje si˛e metody biologii molekularnej. Dzi˛eki pracy na materiale genetycznym, s ˛a one czulsze od stosowanych wcze´sniej, prowadzonych na poziomie komórkowym.

Metoda STR-PCR (ang. short tandem repeat polymerase chain reaction) jest najcz˛e´sciej wykorzystywana. Opiera si˛e na wyst˛epuj ˛acym w genomie polimor-fizmie mikrosatelitarnym [4]. Miejsca polimorficzne charakteryzuj ˛a si˛e nast˛epu-j ˛acymi po sobie powtarzaj ˛acymi si˛e motywami zawieraj ˛acych od 1 do 6 par za-sad, powtórzenia mog ˛a znajdowa´c si˛e w cz˛e´sci promotorowej genu, w intronach lub innych sekwencjach niepodlegaj ˛acych transkrypcji. Dzi˛eki du˙zej zmienno-´sci jest to bardzo informatywna metoda, pozwala w niemal 100% par odró˙zni´c dawc˛e i biorc˛e a dzi˛eki temu monitorowa´c pacjenta po przeszczepie. Dla ka˙zdej pary dawca – biorca nale˙zy ustali´c, która para starterów b˛edzie dawa´c produkt reakcji pozwalaj ˛acy odró˙zni´c dawce i biorc˛e (markery informatywne) i stosowa´c je w dalszych analizach. Obecnie najcz˛e´sciej u˙zywane s ˛a testy komercyjne zawie-raj ˛ace zestaw starterów do przeprowadzenie reakcji multipleksowej. W ka˙zdej parze starterów zawsze jest jeden znakowany fluorochromem, którego ´swiece-157

15. STR i real-time PCR metody badania chimeryzmu poprzeszczepowego

nie, w trakcie rozdziału elektroforetycznego nast˛epuj ˛acego po reakcji PCR, wzbu-dzane jest przez wi ˛azk˛e laserow ˛a. Jest to metoda półilo´sciowa, pozwala ona na wyliczenie procentowej zawarto´sci komórek dawcy i biorcy w badanym materiale pobranym od pacjenta po przeszczepie. Aparatura, na której prowadzi si˛e roz-dział elektroforetyczny produktów reakcji PCR (zwykle s ˛a to sekwenatory), wy-posa˙zona jest w programy do analizy, podaj ˛ace wielko´s´c pola powierzchni pod pikiem odpowiadaj ˛acym produktowi reakcji. Pola powierzchni podstawiane s ˛a do odpowiednich wzorów, zale˙znych od układu pików. Inne wzory s ˛a dla par, u których dawca i biorca zupełnie ró˙zni ˛a si˛e układem pików (nie maj ˛a wspólnych alleli) (Rycina 15.2a), inne dla par z jednym allelem wspólnym (Rycina 15.2b).

A Dawca Biorca Biorca po HSCT 100 x A A + B A B A B C A B C A B C A B C D A B C C D A B 100 x A A + B + C 100 x (A + B) A + B + C 100 x (A + B) A + B + C + D B Dawca Biorca Biorca po HSCT 100 x A A + C C A B 100 x (2B) A + B A B A B C A B A B A A A B 100 - ^{100 x (2B)} A + B

Rycina 15.2: Wzory u˙zywane do obliczenia mieszanego chimeryzmu (odsetka komórek dawcy w badanej próbce): A - dla pary dawca-biorca z ró˙znymi allelami; B - dla par z jed-nym wspóljed-nym allelem.

Kolejne badania prowadzone po przeszczepieniu, z u˙zyciem tych samych par starterów pozwalaj ˛a na ´sledzenie zmian odsetka komórek dawcy i biorcy.

Analiz˛e chimeryzmu mo˙zna równie˙z prowadzi´c z u˙zyciem metody Real-Time PCR. Pozwala ona w czasie rzeczywistym ´sledzi´c logarytmiczny przyrost pro-duktu reakcji co jest proporcjonalne do pocz ˛atkowej ilo´sci badanej matrycy DNA [5]. W tej metodzie najcz˛e´sciej badany jest polimorfizm typu insercja/delecja. Zwykle stosuje si˛e technologi˛e TaqMan, w której poza par ˛a starterów

skierowa-15.4. Podsumowanie nych na miejsce polimorficzne w mieszaninie reakcyjnej jest równie˙z podwójnie znakowana sonda. Na ko ´ncu 5’ znajduje si˛e barwnik reporterowy natomiast na ko ´ncu 3’ wygaszacz. W trakcie reakcji, sonda hybrydyzuje z powielan ˛a komple-mentarna sekwencj ˛a, nast˛epnie w czasie amplifikacji produktu, polimeraza Taq powoduje degradacje sondy, wygaszacz oddziela si˛e od barwnika reporterowego który emituje fluorescencje. Przyrost fluorescencji obserwuje w trakcie trwania reakcji. Jest to metoda, która pozwala otrzyma´c wynik szybciej ni˙z w u˙zywa-j ˛ac metody STR-PCR i charakteryzuje si˛e wi˛eksz ˛a czuło´sci ˛a, jednak nieco wi˛ek-sz ˛a trudno´s´c sprawia dobór markerów informatywnych dla danej pary dawca – biorca.

15.4. Podsumowanie

Oznaczanie chimeryzmu poprzeszczepowego to jeden z elementów diagno-styki prowadzonej u pacjentów po alogenicznej transplantacji komórek krwio-twórczych. Jest to istotne oznaczenie przekładaj ˛ace si˛e na sytuacje kliniczn ˛a, któ-rego wynik mo˙ze by´c podstaw ˛a do dalszego leczenia. Mnogo´s´c dost˛epnych me-tod pozwala wybra´c meme-tod˛e optymaln ˛a, w zale˙zno´sci od posiadanych zasobów aparaturowych oraz kosztów analizy.

Literatura

[1] Dawidowska M., Wachowiak J.: Rozwój bada ´n molekularnych w hematoonkologii – monitorowanie minimalnej choroby resztkowej w ostrej białaczce limfo blastycznej i potransplantacyjnego chimeryzmu hematopoetycznego; Now. Lek., 2007; 76: 282-291

[2] Bader P., Niethammer D., Willasch A., Kreyenberg H., Klingebiel T.: How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation? Bone Mar-row Transplant., 2005; 35: 107-119

[3] Mattsson J., Uzunel M., Remberger M., Ringden O.: T-cell mixed chimerism is signi-ficantly correlated to a decreased risk of acute graft-versus-host disease after alloge-neic stem cell transplantation; Transplantation, 2001; 71: 433-439

[4] Thiede C., Florek M., Bornhauser M. i wsp.: Rapid quantification of mixed chimerism using multiplex amplification of short tandem repeat markers and fluorescence de-tection; Bone Marrow Transplant., 1999; 23: 1055–1060

[5] Alizadeh M., Bernard M., Danic B. i wsp.: Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain re action, Blood, 2002; 99: 4618-4625

R O Z D Z I A Ł

16

WSPÓŁCZESNE TECHNOLOGIE

IDENTYFIKACJI DŁUGO ´SCI TELOMERÓW

Barbara Wysocza ´nska

Zakład Immunologii Klinicznej, Instytut Immunologii i Terapii Do´swiadczalnej, PAN im. L. Hirszfelda we Wrocławiu

Streszczenie

Telomery s ˛a elementami strukturalnymi usytuowanymi na ko ´ncach chromo-somów. Zbudowane z powtarzaj ˛acych si˛e sekwencji nukleotydów (TTAGGG)n wraz z białkami TBP (ang. Telomere Binding Proteins, shelterin) pełni ˛a funkcje ochronne genomu. Współczesne technologie oparte na metodach biologii mole-kularnej umo˙zliwiaj ˛a okre´slenie długo´sci telomerów, aktywno´sci telomerazy oraz prawidłowo´sci ochronnej funkcji kompleksu białek shelterin. Do okre´slenia dłu-go´sci telomerów dost˛epne s ˛a nast˛epuj ˛ace techniki badawcze: Southern blots, TRF (ang. Terminal Restriction Fragment), QPCR (ang. Quantitative Real Time PCR), MLPA (ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), STELA (ang.

Sin-gle Telomere Length Analysis), Q-FISH (ang. Quantitative fluorescence in situ hybri-dization) oraz Flow-FISH (ang. Flow cytometry FISH). Wykorzystanie bada ´n okre-´slaj ˛acych długo´s´c telomerów pozwala na dogł˛ebne zrozumienie mechanizmów przedwczesnego starzenia komórkowego, etapu osi ˛agania stanu spoczynkowego komórki, apoptozy oraz procesu nowotworzenia. Wykazana długo´s´c telomeru nie wpływa na rozpoznanie i prognozowanie, ale mo˙ze by´c pomocna w zrozumieniu biologii komórki nara˙zonej na stres ´srodowiskowy oraz bodziec genotoksyczny.

Słowa kluczowe: telomer, telomeraza, metody identyfikacji długo´sci telomerów

16.1. Wst˛ep

Telomery to nukleoproteinowe elementy strukturalne chromosomów zbudo-wane z powtarzaj ˛acych si˛e sekwencji (TTAGGG)n poł ˛aczonych z białkami TBP (ang. Telomere Binding Proteins). Powtórzenia 6 nukleotydowe zawarte w 92 te-lomerach komórek diploidalnych maj ˛a wielko´s´c od 500 do 2000 powtórze ´n [1]. Liczba powtórze ´n jest zmienna, ale co najmniej 100 powtórze ´n stanowi war-to´s´c krytyczn ˛a dla ochrony chromosomu. Telomery zabezpieczaj ˛a DNA przed rearan˙zacjami prowadz ˛acymi do niestabilno´sci genomu i nieprawidłowo´sciami w kariotypie, chroni ˛ac chromosomy przed zmian ˛a struktury oraz fuzj ˛a. Struk-tury telomeryczne bior ˛a udział w przestrzennej organizacji j ˛adra komórkowego,

16.1. Wst˛ep

segregacji chromosomów podczas podziałów komórki oraz uczestnicz ˛a w

regu-lacji transkrypcji genów zlokalizowanych w ich pobli˙zu. Chroni ˛ac ko ´nce chro-mosomów przed działaniem nukleaz, telomery nie dopuszczaj ˛a do uszkodze ´n

DNA i uruchomienia mechanizmów naprawczych [2]. Telomery s ˛a

molekular-nym zegarem, który informuje komórk˛e o przekroczeniu krytycznej liczby po-działów (50–70x, limit Hayflicka) [3]. Skrócenie telomerów poni˙zej warto´sci 100 powtórze ´n uniemo˙zliwia utrzymanie wła´sciwej struktury przestrzennej telome-rów. Zbyt krótkie telomery s ˛a sygnałem informuj ˛acym o starzeniu si˛e i mog ˛a by´c

rozpoznawane przez mechanizmy reguluj ˛ace cykl komórkowy jako moment

sy-gnalizuj ˛acy konieczno´s´c wstrzymania dalszych podziałów. Długo´s´c telomerów stanowi wyznacznik ł ˛acznego ryzyka genetycznego i ´srodowiskowego, który od-zwierciedla okre´slony styl ˙zycia [4]. Współczesne metody biologii molekularnej pozwalaj ˛a na identyfikacj˛e długo´sci telomerów, okre´slenie aktywno´sci telome-razy oraz na wykrycie zmian dotycz ˛acych struktury białek chroni ˛acych (ang. shel-terin) [5]. Nie zdefiniowano dotychczas jaka długo´s´c telomerów jest norm ˛a, na-tomiast udokumentowano w jakich sytuacjach skracanie telomeru jest niepra-widłowo´sci ˛a. Wiedza o biologii telomeru wymaga podj˛ecia decyzji dotycz ˛acych zmian stylu ˙zycia, bowiem długo´s´c telomerów jest krytycznym wyznacznikiem ł ˛acznego ryzyka genetycznego i ´srodowiskowego (np. okre´slonej diety, aktywno-´sci fizycznej, nara˙zanie na stres, bodziec genotoksyczny). Schemat budowy telo-meru przedstawiono na Rycinie 16.1.

Punktem wyj´scia do nieodwracalnego zatrzymania podziałów komórkowych, ´swiadcz ˛acych o starzeniu komórkowym (ang. senescence), s ˛a trwałe nienapra-wialne uszkodzenia DNA. Starzenie komórkowe wyst˛epuje na skutek skracania telomerów, pozbawienia prawidłowej funkcji białek ochronnych np. w wyniku stresu oksydacyjnego, czy te˙z genotoksycznego. Obecnie uwa˙za si˛e, ˙ze kompleks

niekorzystnych zmian ´srodowiskowych, zwi ˛azanych z metabolizmem

mitochon-driów oraz regulacja długo´sci telomerów jest sygnałem do przedwczesnego sta-rzenia si˛e komórkowego [6]. Na Rycinie 16.2 przedstawiono schemat dynamiki procesu skracania si˛e telomerów, który obserwuje si˛e pocz ˛awszy od stadium

ko-T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G G G 3’ A T C C C A A T C C C T A A A T - 5’ DNA SHELTERIN COMPLEX TELOMERAZA - ’ 5

Rycina 16.1: Telomery zbudowane s ˛a z tandemowo powtórzonych sekwencji 6 nukleoty-dowych (TTAGGG)n poł ˛aczonych z szeregiem wyspecjalizowanych białek (shelterin) wa-runkuj ˛acych stabilno´s´c ko ´nca chromosomu. Struktura telomerów chroni genom przed uszkodzeniami oraz niekontrolowanym ł ˛aczeniem si˛e wolnych ko ´nców ła ´ncuchów DNA. Telomeraza odpowiada za wydłu˙zanie si˛e telomerów.

16. Współczesne technologie identyfikacji długo´sci telomerów STRES ŒRODOWISKOWY

DEFEKT GENETYCZNY STARZENIE, BRAK PODZIA£U KOM. DEGENRACJA CHOROBY DOJRZA£A KOMÓRKA MACIE¯YSTA (SC) SKRACANIE D£UGOŒCI TELOMERU KRYTYCZNA LICZBA 100 POWTÓRZEÑ TTAGGG K. ZRÓ¯NICOWANA 500-2000 POWTÓRZEÑ TTAGGG TEL p53 CHROMOSOMYBEZ TELOMERÓW S¥ £AMLIWE NOWOTWORZENIE APOPTOZA p53 TEL TEL TEL

Rycina 16.2: Długo´s´c telomerów jest najwy˙zsza w komórkach multipotencjalnych, kiedy obserwowana jest wysoka aktywno´s´c telomerazy (TEL). Podczas procesów ˙zyciowych ko-mórki długo´s´c telomerów ulega sukcesywnemu skróceniu. W komórce zró˙znicowanej obserwuje si˛e ok. 500-2000 powtórze ´n TTAGGG. Proces skracania si˛e telomerów mo˙ze by´c wzmo˙zony poprzez działanie bod´zców ´srodowiskowych, stresu oksydacyjnego, de-fektów genetycznych. Nast˛epuje starzenie komórkowe, ustaj ˛a podziały, przyspieszony zostaje proces degeneracyjny, podatno´s´c na choroby wzrasta. Krytyczna liczba stu po-wtórze ´n telomerycznych zwi˛eksza podatno´s´c chromosomów do fuzji i ich łamliwo´sci. Brak aktywno´sci genów supresorowych np. p53 sprzyja genetycznym zmianom prowa-dz ˛ac do procesu nowotworzenia. Rycina zmodyfikowana wg [7].

mórki multipotencjalnej do stadium komórki spoczynkowej, apoptotycznej i no-wotworowej.