PCR-ASO - przył ˛ aczanie allelicznie specyficznych sond

PCR-ASO jest jedn ˛a z najprostszych metod oznaczania alleli w miejscu poli-morficznym. Do zastosowania tej metody konieczne jest zaprojektowanie dwóch sond, z których ka˙zda przył ˛acza si˛e tylko i wył ˛acznie do jednej formy allelicznej. Warunki hybrydyzacji sondy s ˛a ´sci´sle dobrane, tak aby niesparowanie jednej za-sady uniemo˙zliwiało zwi ˛azanie sondy. Istnieje wiele wariantów tej metody.

W jednym z wariantów jedna z dwóch allelicznie specyficznych sond jest zna-kowana, druga natomiast nie. Reakcj˛e hybrydyzacji przeprowadza si˛e w dwóch osobnych naczyniach reakcyjnych: w jednym sonda pierwsza jest znakowana a druga nie, a w drugiej probówce pierwsza sonda jest bez znacznika natomiast druga sonda jest znakowana. Pojawienie si˛e sygnału pochodz ˛acego od znacznika ´swiadczy o obecno´sci specyficznego dla danej sondy allelu. Stosuje si˛e wiele me-tod znakowania sond m.in. kolorymetryczne, immunofluorescencyjne, fluore-scencyjne.

Odmiany metody PCR-ASO s ˛a cz˛esto wykorzystywane przy typowaniu

specy-ficzno´sci HLA: na membranie, pasku, etc. naniesione s ˛a znakowane sondy dla 171

17. Genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu

okre´slonych specyficzno´sci allelicznych i w odpowiednich warunkach tempera-tury i pH przeprowadza si˛e hybrydyzacj˛e z powielonym badanym materiałem ge-netycznym. Je˙zeli dany allel wyst˛epuje w badanej próbce nast˛epuje przył ˛aczenie si˛e DNA do specyficznej znakowanej sondy i uwolnienie znacznika.

Odmian ˛a tej metody jest równie˙z metoda PCR-SSP, w której zamiast sond

dopasowanych do specyficznych alleli wykorzystuje si˛e startery dopasowane do okre´slonych form allelicznych. Reakcj˛e przeprowadza si˛e osobno dla ka˙zdego specyficznego startera (starter revers jest dla obu przypadków jednakowy). Je-˙zeli allel, do którego starter jest dopasowany wyst˛epuje, wówczas nast˛epuje jego przył ˛aczenie, zachodzi reakcja PCR i produkt jest namna˙zany. Je˙zeli dany allel nie wyst˛epuje reakcja PCR nie zachodzi. Metoda ta jest równie˙z szeroko stosowana w typowaniu HLA, gdy˙z pozwala oznaczy´c wiele SNP w jednej próbce DNA.

W badaniach wymagaj ˛acych okre´slenia SNP w du˙zej liczbie próbek cz˛esto wy-korzystuje si˛e metody, w których przeprowadza si˛e hybrydyzacj˛e z dwiema son-dami komplementarnymi do ró˙znych alleli jednocze´snie. Odmian ˛a takiej metody jest oznaczanie alleli przy u˙zyciu sond TaqMan przy wykorzystaniu aparatu do real-time PCR [5, 6].

Podobnie jak w przypadku PCR-ASO sondy s ˛a specyficzne dla ka˙zdego z alleli i znakowane ró˙znymi barwnikami fluorescencyjnymi. W metodzie tej wykorzy-stywane jest zjawisko FRET (ang. fluorescence resonance energy transfer) tzn. wy-chwytywanie energii emitowanej przez jeden fluorochrom (donor) przez drugi blisko poło˙zony fluorochrom (acceptor-quencher). Sondy TaqMan s ˛a znakowane

na 5’ ko ´ncu dwoma ró˙znymi barwnikami (donorami) dla dwóch ró˙znych

spe-cyficzno´sci allelicznych, natomiast na 3’ ko ´ncu zawieraj ˛a zazwyczaj wygaszacz wspólny dla obu donorów. Poniewa˙z w sondzie odległo´s´c pomi˛edzy donorem a wygaszaczem jest niewielka, energia emitowana przez donor jest pochłaniana przez wygaszacz. W trakcie reakcji PCR sonda przył ˛acza si˛e komplementarnie do matrycy w miejscu polimorficznym. W czasie reakcji PCR wykorzystuje si˛e 5’-egzonukleazow ˛a własno´s´c Taq polimerazy. Polimeraza dobudowuj ˛ac ła ´ncuch

do matrycy odcina nukleotydy sondy uwalniaj ˛ac znakowany nukleotyd. Gdy

zwi˛eksza si˛e odległo´s´c donora od wygaszacza nast˛epuje emisja fluorescencji (Ry-cina 17.1).

Tak jak inne sondy, sonda TaqMan powinna charakteryzowa´c si˛e Tm około 70°C, znacz ˛aco wy˙zsz ˛a od Tm starterów. Dzi˛eki temu, podczas etapu przył ˛ a-czania i wydłu˙zania starterów, który przebiega w temp. 60°C, kompleks sonda-matryca pozostaje stabilny. W sytuacjach, w których projektuje si˛e sondy dla sekwencji bogatych w pary AT uzyskanie Tm dupleksu sonda-matryca zbli˙zonej do 70°C jest trudne b ˛ad´z niemo˙zliwe. Je˙zeli Tm dupleksu jest zbyt niska, sonda nie wi ˛a˙ze si˛e stabilnie z matryc ˛a, i w takiej sytuacji polimeraza Taq zamiast tra-wi´c koniec 5’ sondy, powoduje jej odł ˛aczenie od nici matrycowej (tzw. „zrzucanie sondy”). Aby zwi˛ekszy´c temperatur˛e topnienia sondy do jej 3’ ko ´nca przył ˛acza si˛e cz ˛asteczk˛e wi ˛a˙z ˛ac ˛a si˛e do mniejszej bruzdy podwójnej helisy tworzonej przez kompleks sondy i matrycy - MGB (ang. minor groove binder) [7].

Przy genotypowaniu z u˙zyciem sond TaqMan przeprowadza si˛e wst˛epny etap odczytu fluorescencji z płytki przed reakcj ˛a PCR (pomiar tła), nast˛epnie

prze-17.2. PCR-ASO - przył ˛aczanie allelicznie specyficznych sond A V Q F Q G Sonda ^MGB Sonda ^MGB 5’ 3’ 3’ 5’ [G/A]

1. Sk³adniki mieszniny reakcyjnej i matryca DNA

Matryca DNA 3’ 5’ V Q F Q G A Sonda ^MGB Sonda ^MGB 3’ 5’ 5’ 3’ Starter przedni Starter przedni

Starter przedni Starter tylni

[C/T] [C/T]

[C/T]

2. Przy³¹czanie starterów oraz hybrydyzacja sondy

3. Elongacja i generacja sygna³u ^{5’ 3’}

F Q Sonda ^MGB Starter tylni Starter tylni MGB V G Q V Q Startery MGB F Wygaszacz Minor Groove

Binder ^{Sonda Matryca DNA}

Polimeraza DNA VIC Barwnik®

FAM™ Barwnik

A

Rycina 17.1: Schemat reakcji genotypowania przy u˙zyciu sond TaqMan. W mieszani-nie reakcyjnej znajduj ˛a si˛e startery oraz dwie sondy znakowane na 5’ ko ´ncu dwoma ró˙z-nymi barwnikami oraz posiadaj ˛ace na 3’ ko ´ncu cz ˛asteczk˛e MGB, która jest wygaszaczem. Ka˙zda z sond jest specyficzna do jednego z alleli wyst˛epuj ˛acych w danym SNP. Ze wzgl˛edu na blisk ˛a odległo´s´c pomi˛edzy znacznikiem fluorescencyjnym (zazwyczaj VIC lub FAM) a cz ˛asteczk ˛a MGB, fluorescencja znacznika jest pochłaniana i sonda nie ´swieci. W czasie reakcji PCR sonda wi ˛a˙ze si˛e komplementarnie do odpowiedniego allelu. Podczas etapu wydłu˙zania startera (elongacji), polimeraza Taq (ze wzgl˛edu na swoj ˛a aktywno´s´c egzonu-kleazow ˛a) w momencie napotkania przył ˛aczonej sondy, odcina po kolei zwi ˛azane nukle-otydy. Powoduje to oderwanie si˛e znakowanej na 5’ ko ´ncu zasady, zwi˛ekszenie odległo´sci od wygaszacza, a w konsekwencji ´swiecenie barwnika fluorescencyjnego. W reakcji ge-notypowania przeprowadza si˛e odczyt fluorescencji przed reakcj ˛a PCR w celu pomiaru tła oraz drugi odczyt po reakcji PCR, w której bada si˛e fluorescencj˛e VIC i FAM. W przy-padku osobników homozygotycznych pojawia si˛e fluorescencja tylko od jednego barw-nika, a w przypadku heterozygot od dwóch barwników [8].

17. Genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu

prowadza si˛e reakcj˛e PCR, a po jej zako ´nczeniu po raz kolejny nast˛epuje pomiar uwolnionej fluorescencji (Ryciny 17.1, 17.2, 17.3).

Zastosowanie sond TaqMan w oparciu o gotowe zestawy odczynników (np. firmy Life Technologies) nie wymaga optymalizacji i walidacji. Jest to metoda szybka, mało pracochłonna, czuła (wymagaj ˛aca niewielkiej ilo´sci DNA - ok. 15 ng na próbk˛e) i dostarczaj ˛aca wiarygodnych wyników. Wyniki niejednoznaczne zda-rzaj ˛a si˛e niezwykle rzadko.

10 000 8 000 6 000 4 000 2 000 0 Allelic Discrimination A lle le Y (J O _ 3 1 a lle l A )

Allele X Allele Y Both NTC Undetermined Allele X(JO_31 allel C)

2 000 4 000 6 000

0

Rycina 17.2: Odczyt po reakcji post-PCR - w zakładce „Results”. Romby obrazuj ˛a fluore-scencj˛e fluorochromu VIC, którym w przedstawionym na rysunku badaniu znakowany był allel A, kółka obrazuj ˛a fluorescencj˛e barwnika FAM, którym znakowany był allel C, natomiast trójk ˛aty przedstawiaj ˛a fluorescencj˛e obu znaczników i ´swiadcz ˛a o obecno´sci heterozygot. A B Component F lu o re s c e n c e 1 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 CYCLES 1.0e+05 2.0e+05 3.0e+05 4.0e+05 5.0e+05 6.0e+05

FAM ROX VIC

Component F lu o re s c e n c e 1 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 CYCLES 8.0e+04 1.2e+05 1.6e+05 2.0e+05 2.4e+05 2.8e+05

FAM ROX VIC 3.2e+05

Rycina 17.3: Przykładowy obraz fluorescencji A) FAM, homozygota CC, B) VIC i FAM, he-terozygota AC.

17.3. Reakcja wydłu˙zania startera o jeden nukleotyd ...

17.3. Reakcja wydłu˙zania startera o jeden nukleotyd