D Z I A Ł
14
ABERRACJE STRUKTURALNE DNA
W NOWOTWOROWYCH ROZROSTACH
Z KOMÓRKI MACIERZYSTEJ HEMATOPOEZY
Marta Libura, Marta Przestrzelska, Marta Wi˛esik, Karolina Karabin, Patrycja Rybarczyk, Albert MoskowiczPracownia Diagnostyki Molekularnej BKK Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewn˛etrznych SPCSK WUM Warszawa
Streszczenie
W ostatnich latach dokonał si˛e istotny post˛ep w leczeniu hematologicznych roz-rostów nowotworowych. Post˛ep ten nie byłby mo˙zliwy bez rozwoju diagnostyki. Diagnozowanie molekularnego podło˙za choroby, w tym z zastosowaniem wysoko-rozdzielczych technik genetycznych, umo˙zliwia z jednej strony podjecie wła´sciwych decyzji terapeutycznych, z drugiej, stratyfikuje prognoz˛e i pozwala na wł ˛aczenie b ˛ad´z odst ˛apienie od agresywnych procedur. Wi˛ekszo´s´c stosowanych w diagnostyce molekularnej metod oparta jest o ła ´ncuchow ˛a reakcj˛e polimerazy (ang.
polyme-rase chain reaction, PCR) z nast˛epow ˛a wizualizacj ˛a produktów PCR. W zale˙zno´sci od typu aberracji: i) aberracje zwi ˛azane z przemieszczeniem du˙zych fragmentów DNA (np. translokacje chromosomowe); ii) mutacje wewn ˛atrzgenowe, stosuje si˛e ró˙zne techniki wizualizacji. Produkty amplifikacji genów fuzyjnych s ˛a poddawane wizualizacji w ˙zelu agarozowym, podczas gdy detekcja np. substytucji pojedynczego nukleotydu wymaga zastosowania sekwenatora, umo˙zliwiaj ˛acego okre´slenie zmian genetycznych z rozdzielno´sci ˛a do 1 pary zasad. Obok etapu diagnostycznego, tech-niki molekularne znajduj ˛a swoje zastosowanie w monitorowaniu post˛epów lecze-nia, w szczególno´sci w ´sledzeniu choroby resztkowej. Jest to mo˙zliwe dzi˛eki wysokiej czuło´sci reakcji PCR, która umo˙zliwia wykrycie 1 komórk˛e chor ˛a na milion komó-rek zdrowych. Poniewa˙z lista markerów molekularnych ci ˛agle ro´snie, niezb˛ednym jest proces standaryzacji oraz doboru do rutynowych oznacze ´n jedynie tych aberra-cji, których znaczenie prognostyczne zostało potwierdzone w ramach wieloo´srod-kowych prób klinicznych.
Słowa kluczowe: PCR, genetyka, diagnostyka molekularna, geny fuzyjne, rearan˙zacje
14. Aberracje strukturalne DNA w nowotworowych rozrostach ...
14.1. Wst˛ep
Punktem wyj´sciowym dla ka˙zdego rozrostu nowotworowego jest powstanie mutacji DNA, która w nast˛epstwie zmienia funkcj˛e genów ˙zyciowo wa˙znych. Aberracja DNA w swoim nast˛epstwie inicjuje proces transformacji nowotworo-wej tj. okre´slone zmiany fenotypu komórki, prowadz ˛ace do niekontrolowanych podziałów, bloku ró˙znicowania oraz zahamowania odpowiedzi na bod´zce apop-totyczne. W procesie transformacji dochodzi do zaburze ´n wielu szlaków metabo-licznych komórki m.in. procesu metylacji DNA, ekspresji genów oraz mikro-RNA, procesu rozkładania białek (tzw. turnover).
Podło˙ze genetyczne rozrostów hematologicznych jest wysoce heterogenne. Wiele zmian genetycznych nie zostało z pewno´sci ˛a do tej pory opisanych. Struk-turalne aberracje materiału genetycznego, odpowiedzialne za transformacj˛e ko-mórki macierzystej hematopoezy s ˛a klasyfikowane jako: i) aberracje zwi ˛azane z przemieszczeniem du˙zych fragmentów DNA (tzw. „du˙ze” aberracje) - wi-doczne pod mikroskopem ´swietlnym w klasycznym badaniu cytogenetycznym jako translokacje chromosomowe, du˙ze delecje, inwersje, insercje etc; ii) mu-tacje wewn ˛atrzgenowe, które pozostaj ˛a niewidoczne w mikroskopie ´swietlnym (tzw. kariotyp prawidłowy; normal kariotype NK), i polegaj ˛a na zmianach se-kwencji w obr˛ebie jednego genu: mikro-delecje, -inwersje, -insercje –duplikacje, mutacje punktowe. O ile „du˙ze” aberracje materiału genetycznego s ˛a technicz-nie prostsze w analizie, o tyle detekcja rearan˙zacji wewn ˛atrzgenowych – wymaga bardziej skomplikowanych metod, cz˛esto zakładaj ˛acych rozdzielczo´s´c na pozio-mie jednej pary zasady. Metody umo˙zliwiaj ˛ace detekcj˛e „du˙zych” aberracji to: i) metody cytogenetyczne oraz ii) molekularne oparte o ła ´ncuchow ˛a reakcj˛e poli-merazy (ang. polymerase chain reaction, PCR) z nast˛epow ˛a wizualizacj ˛a produk-tów PCR w ˙zelu agarozowym. Ta ostatnia metoda umo˙zliwia detekcj˛e jedynie translokacji, w tym tych, które prowadz ˛a do ekspresji genów fuzyjnych. Nato-miast przy pomocy PCR nie mo˙zliwa jest detekcja ubytków lub amplifikacji mate-riału genetycznego (du˙ze delecje, amplifikacje, insercje etc), które podlegaj ˛a de-tekcji metodami cytogenetyki klasycznej. Badanie genów fuzyjnych przy pomocy PCR wydaje si˛e prostym zadaniem, poniewa˙z detekcji podlega patologiczny pro-dukt, który nie wyst˛epuje w zdrowej komórce. St ˛ad badanie metod ˛a PCR osi ˛aga tu wysok ˛a czuło´s´c (do 10−6tj. 1 komórka patologiczna na 1 000 000 komórek zdro-wych), co wykorzystywane jest w monitorowaniu choroby resztkowej (ang. mini-mal residual disease, MRD). Natomiast aberracje wewn ˛atrzgenowe dotycz ˛a ma-łego obszaru DNA - cz˛esto pojedynczej zasady, i wyst˛epuj ˛a najcz˛e´sciej w jednym allelu badanego genu (heterozygota). Detekcja polega zatem na ocenie patolo-gicznej sekwencji genu, który współistnieje w mieszaninie cz ˛asteczek DNA/RNA o prawidłowej sekwencji (tzw. dziki allel; wildtype); st ˛ad wymagane s ˛a metody o stosunkowo du˙zej rozdzielczo´sci, ale przez to o ni˙zszej czuło´sci je´sli chodzi o ilo´sciowe proporcje aberracji w badanym materiale. W´sród tych metod sekwen-cjonowanie pozostaje technik ˛a referencyjn ˛a (czuło´s´c waha si˛e w przedziale 10%
-20%). Natomiast do metod przesiewowych nale˙zy wysokosprawna denaturuj ˛aca
chromatografia cieczowa (dHPLC), wysokorozdzielcza analiza krzywych topnie-nia amplikonów (HRM), analiza długo´sci fragmentów (GeneScan; dotyczy
aber-14.2. Diagnostyka molekularna „du˙zych” aberracji w ostrej białaczce szpikowej (OBSZ) racji długo´sci, za wyj ˛atkiem mutacji punktowych), analiza fragmentów restryk-cyjnych (RFLP), elektroforeza w podwójnym gradiencie g˛esto´sci i czynnika
de-naturuj ˛acego (DGGE), konformacyjny polimorfizm jednoniciowego DNA (SSCP),
PCR z zastosowaniem allelo-specificznego primeru (ASO-PCR) i inne [1]. Dodat-kowo, w grupie chorych z NK dokładniejszy wgl ˛ad w anomalie submikroskopowe jest mo˙zliwy dzi˛eki nowym technikom molekularnym, takim jak metoda mikro-macierzy polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide poli-morphism arrays, aSNP).
Jednostkami chorobowymi omawianymi w tym rozdziale s ˛a te rozrosty
he-matologiczne, dla których oznaczanie wybranych aberracji genetycznych po-siada udokumentowane znaczenie kliniczne, a dodatkowo mo˙zliwo´sci ich bada ´n mieszcz ˛a si˛e w publicznym bud˙zecie przewidzianym dla rutynowych oznacze ´n diagnostyki molekularnej. Chorobami, które na dzisiejszy dzie ´n spełniaj ˛a te kli-niczno - ekonomiczne kryteria s ˛a w głównej mierze: przewlekła i ostra białaczka szpikowa (PBSz, OBSz), jak równie˙z ostra białaczka limfoblastyczna (OBL).
14.2. Diagnostyka molekularna „du˙zych” aberracji
w ostrej białaczce szpikowej (OBSZ)
W OBSz proces nowotworowy wywodzi si˛e z komórek progenitorowych szpiku poprzez zaburzenie dwóch procesów: proliferacji i ró˙znicowania. Według teorii „dwóch uderze ´n” (ang. two-hit model of leukemogenesis) do rozwoju pełnoobja-wowej OBSz dochodzi w dwóch etapach: z jednej strony aktywacji receptorowych kinaz tyrozynowych (ang. tyrosine kinase, TK), kodowanych np. przez geny FLT3, C-KIT oraz mutacji genów czynników transkrypcyjnych (CBF, MLL, RARA, EVI1, CEBPA, TEL, itd.), które blokuj ˛a dojrzewanie progenitorów, ze znikomym wpły-wem na ich proliferacj˛e [2, 3].
Klasyczny podział OBSz powstały w oparciu o wyniki badania cytogenetycz-nego umo˙zliwia wyodr˛ebnienie trzech grup chorych o ró˙znym rokowaniu [4]: chorzy z korzystnym (15-30% OBSz), niekorzystnym (10-30%) oraz po´srednim ro-kowaniem (40-60% OBSz).
Klasyczne aberracje korzystnie rokuj ˛ace, (t(8;21)/AML1-ETO; inv(16)/ CBFβ-MYH11, lub t(16;16); oraz t(15;17)) definiuj ˛a w miar˛e jednorodn ˛a grup˛e białaczek o morfologii odpowiednio M2 (OBSz z cechami dojrzewania), M4Eo (ostra łaczka mielomonocytowa z zaburzeniami eozynocytopoezy), oraz M3 (ostra bia-łaczka promielocytowa). Na osobn ˛a uwag˛e zasługuj ˛a białaczki z rearan˙zacj ˛a genu CBFα lub CBFβ, czyli wykazuj ˛ace ekspresj˛e genów fuzyjnych: AML1/CBFα-ETO (inna nazwa genów wchodz ˛acych w skład tej fuzji genowej: to RUNX1-RUNX1T1)
lub CBFβ-MYH11. Białaczki te zwane s ˛a core binding factor OBSz (CBF-OBSz)
i, pomimo ˙ze wykazuj ˛a ró˙znice w fenotypie (M2 vs M4Eo), mechanizm ich trans-formacji oraz rokowanie s ˛a zbli˙zone. Translokacja t(15;17)(q22;q12-21) PML-RARA odpowiada za molekularne przyczyny powstania ostrej białaczki
promie-locytowej (OBSz M3). Gen RARA koduje receptor kwasu α-retinowego, st ˛ad
w terapii białaczki promielocytowej wykorzystywany jest preparat ATRA (all-trans retinoic acid). Bardzo rzadkimi przypadkami białaczek, w których bie-147
14. Aberracje strukturalne DNA w nowotworowych rozrostach ...
rze udział gen receptora kwasuα-retinowego (RARA) s ˛a m.in. t(5,17)(q35;q21)/ NPM1-RARA oraz t(11,17)(q13;q21)/ NUMA-RARA – oba białka zwi ˛azane z wra˙z-liwo´sci ˛a na ATRA, jak równie˙z wariant oporny na leczenie kwasem retinolowym: t(11;17)(q23;q21)/ PLZF-RARA [5].
Do niekorzystnie rokuj ˛acych aberracji zalicza si˛e m.in. aberracje
obejmu-j ˛ace gen MLL (11q23), delecje długich ramion i monosomie chromosomów
5 i 7 (-5/5q-, -7/7q-), translokacje 3q21 i 3q26, t(6;9)(p23;q34)/DEK-CAN,
t(8;16)(p11;p13)/MOZ-CBP oraz mnogie aberracje chromosomowe, składaj ˛ace
si˛e na tzw. kariotyp zło˙zony. Z przedstawionych powy˙zej aberracji jedynie fuzje
genu MLL, DEK-CAN, MOZ-CBP s ˛a oznaczane metodami molekularnymi,
pod-czas gdy reszta zmian podlega detekcji w rutynowo zlecanym badaniu cytogene-tycznym.
Chorzy z prawidłowym kariotypem, bez widocznych w mikroskopie ´swietl-nym aberracji wykazuj ˛a po´srednie ryzyko nawrotu choroby.