CHIMERYZMU POPRZESZCZEPOWEGO Anna Młynarczewska
16.2. Metody identyfikacji długo´sci telomerów
Okre´slenie długo´sci telomerów jest pomocne w kontek´scie bada ´n nad pro-cesem starzenia si˛e komórki, uwarunkowaniem rozwoju choroby i okre´sleniem biomarkerów zwi ˛azanych z procesem nowotworzenia. W chwili obecnej istnieje wiele metod opartych na technologiach biologii molekularnej, które okre´slaj ˛a zmieniaj ˛ac ˛a si˛e w czasie długo´s´c telomerów. Wybór odpowiedniej techniki jest uwarunkowany liczebno´sci ˛a grupy badanej, dost˛epno´sci ˛a materiału biologicz-nego oraz wyborem stopnia precyzji pomiaru. W sytuacji, gdy setki/tysi ˛ace pró-bek wymagaj ˛a testowania przeprowadza si˛e zwykle reakcj˛e QPCR, która jest je-dyn ˛a metod ˛a o wysokiej przepustowo´sci i stanowi strategicznie dobrze dost˛epne
narz˛edzie do wykorzystania. QPCR mo˙ze by´c wykorzystany do bada ´n
epide-miologicznych, klinicznych oraz aplikacji przesiewowych. QPCR jest mniej do-godny dla bada ´n zło˙zonych z niewielkiej liczby próbek, pochodz ˛acych z bardzo unikatowej populacji, w której wymagany jest bardzo precyzyjny pomiar. Dla liczby 20-50 próbek mo˙ze by´c wykorzystany Flow-FISH, poniewa˙z w tej zło˙zo-nej z cytometrii i hybrydyzacji genetyczzło˙zo-nej metodzie mo˙zna bada´c i analizowa´c wiele typów unikatowych komórek jednocze´snie, dotyczy to równie˙z
ba-16.2. Metody identyfikacji długo´sci telomerów dania małych liczbowo próbek (około 5-10 i 1-5 próbek). Flow-FISH jest bar-dzo dokładn ˛a technologi ˛a przydatn ˛a w badaniach populacyjnych i badaniach o wydłu˙zonym czasie obserwacji [9]. Ograniczenia co do wyboru metod wyst˛e-puj ˛a odno´snie ilo´sci i rodzaju materiału wyj´sciowego oraz czuło´sci i rozdzielczo-´sci danej techniki [10]. Omówione poni˙zej wybrane technologie stanowi ˛a pod-staw˛e metodologiczn ˛a dla oznaczania długo´sci telomerów w zró˙znicowanych sy-tuacjach badawczych i klinicznych. Współczesne metody identyfikuj ˛ace długo´s´c telomerów oparte s ˛a na technologii: Southern blots (podstawa TRF, ang. Termi-nal restriction fragment), PCR czasu rzeczywistego (QPCR), MLPA (ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), STELA (ang. Single TElomere Length Analysis), Q-FISH (ang. Quantitative fluorescence in situ hybridization) oraz Flow-FISH (ang. Flow cytometry - Flow-FISH). Metody te pozwalaj ˛a na okre´slenie długo´sci telomerów na wysokim poziomie czuło´sci i rozdzielczo´sci. Charakterystyk˛e wy-branych metod podano w Tabeli 16.1.
Tabela 16.1: Porównanie wybranych parametrów charakteryzuj ˛acych metody oznaczania długo´sci telomerów. Tabela zmodyfikowana wg [10].
Metoda Materiał wyj´sciowy Rozdzielczo´s´c
TRF 1-3×106kom DNA
0,5-10ug
1kb ´srednia długo´s´c telome-rów w badanej populacji komórek
STELA 1×105kom DNA
(<100 pg)
0,1kb metoda specyficzna dla pojedynczego chro-mosomu i krótkich telomerów
QPCR 20ng/reakcj˛e DNA nd (T)/(S)
T liczba kopii telomer S liczba kopii standard Q-FISH 10-20 metafaz
<300 kom
DNA (<100 pg)
0,3kb wolne ko ´nce chrom. fuzje chromosomów metafazy FLOW-FISH 15-20 metafaz 0,5-3×106kom ´swie˙zo izolowane WBC 0,2-0,3kb barwienie - cytometr specyf. populacji kom.
16.2.1. TRF (ang. Terminal Restriction Fragment)
Metoda TRF oparta jest na technologii Southern blots. Technika TRF wymaga 1-3×106 komórek (0,5-10 µg DNA), jej rozdzielczo´s´c wynosi 1 kb. Metoda nie znajduje zastosowania do analizy bardzo krótkich powtórze ´n telomerowych. Me-toda jest pomocna do walidacji i kalibrowania nowowprowadzonych metod dla okre´slenia długo´sci telomerów. Genomowe DNA wykorzystane w tej metodzie podlega ci˛eciu przez enzymy restrykcyjne (Hph1/Mnf1, Hinf1/Rsa1), które trawi ˛a
miejsca DNA bez powtórze ´n telomerowych. Pozostałe fragmenty DNA
16. Współczesne technologie identyfikacji długo´sci telomerów
nione zostaj ˛a w ˙zelu agarozowym, przeniesione na membran˛e nylonow ˛a hybry-dyzuj ˛a ze znakowan ˛a sond ˛a specyficzn ˛a dla telomerów. Wywołanie produktów mo˙ze równie˙z nast ˛api´c dzi˛eki wykorzystaniu komercyjnych zestawów chemilu-minescencyjnych (TeloTAGGG Telomere Lenngth Assay, Roche) [8].
16.2.2. MLPA (ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Metoda identyfikuje mikrodelecje i mikroduplikacje wyst˛epuj ˛ace w regionie subtelomerowym, pozwalaj ˛ac okre´sli´c długo´s´c telomerów za pomoc ˛a poł ˛aczenia dwóch technologii PCR i ligacji sond. Konstrukcja sond u˙zywanych w tej meto-dzie opiera si˛e na specyficznych wstawkach ró˙znej długo´sci, ligacja wzajemna sond stanowi podstaw˛e do uzyskania pozytywnego wyniku w reakcji PCR (Ry-cina 16.3). Do reakcji wykorzystuje si˛e ok. 200 – 400 ng genomowego DNA wy-sokiej jako´sci, zestaw specyficznych sond, ligaz˛e oraz zestaw starterów
znako-wanych fluorescencyjnie (MLPA kit, MRC-Holland,http://www.mrc-holland.
com). Odczyt i analiza reakcji MLPA przebiega z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej oraz programów specjalistycznych Genescan Analysis Software i Ge-notyper software (Applied Biosystems). Najnowsze prace badawcze i kliniczne opieraj ˛a si˛e na wykorzystaniu tego testu do analizy długo´sci telomerów i zmian subtelomerowych, popartych niejednokrotnie odr˛ebnym testem np. FISH [11].
HYBRYDYZACJA SOND PO£ÓWKOWYCH
LIGACJA LIGACJA LIGACJA 1 2 3 ROZDZIAL KAPILARNY 1 2 3
Rycina 16.3: Metoda MLPA opiera si˛e na reakcji PCR (amplifikacja multipleks) zale˙znej od ligacji sond. MLPA polega na hybrydyzacji zestawu podwójnych sond z DNA, ligacji, a nast˛epnie amplifikacji badanych fragmentów, dzi˛eki obecno´sci uniwersalnych starte-rów [12].
16.3. STELA (ang. Single TElomere Length Analysis)
Znacz ˛aca utrata telomerowego DNA jest potencjalnie wa˙zna w wywoływaniu starzenia komórkowego i zwi˛ekszenia cz˛esto´sci wyst ˛apienia fuzji mi˛edzy
chro-16.3. STELA (ang. Single TElomere Length Analysis)
mosomami. Obecnie tylko metoda STELA i Q-FISH maj ˛a zdolno´s´c wykrywania
tych statystycznie istotnych odst˛epstw od ´sredniej długo´sci telomerów. Metoda ta wykorzystuje fakt, ˙ze wszystkie nici z ko ´nca jednego telomeru 3’ s ˛a bogate w Gu-anin˛e, tote˙z ligacja oligonukleotydów specyficznych dla 5’ ko ´nca telomeru prze-biega za pomoc ˛a specyficznego szablonu. Starter specyficzny zawiera ł ˛acznik dla unikalnej sekwencji subtelomerowej i generuje krótkie produkty dla indywidu-alnego amplikonu odzwierciedlaj ˛acego pojedynczy telomer (Rycina 16.4). Głów-nym zastrze˙zeniem do stosowania tej metody jest to, ˙ze nie wszystkie ko ´nce chro-mosomów maj ˛a odpowiednio dobran ˛a sekwencj˛e do projektowania unikalnych starterów dla ramion chromosomów, a wi˛ec technologia STELA jest zwykle
ogra-niczona do kilku dobrze scharakteryzowanych ko ´nców chromosomalnych: XpYp,
2p, 11q, 12q i 17p [13]. Najwi˛eksz ˛a zalet ˛a metody STELA jest zdolno´s´c do gene-rowania bardzo dokładnych pomiarów długo´sci telomerów z ograniczeniem ilo-´sci wyjilo-´sciowego materiału DNA i liczby komórek (pg DNA, 50 komórek). Metod˛e wykorzystuje si˛e do analizy rzadko wyst˛epuj ˛acych typów komórek. Podczas gdy miejsca restrykcyjne w analizie TRF s ˛a niezbyt precyzyjnie okre´slone w regionie sub-telomerowym, to w metodzie STELA miejsce pomiaru jest znane i stabilne mi˛edzy poszczególnymi komórkami, długo´s´c telomerów jest mierzona precyzyj-nie (0,1kb) [14, 15]. TTAA AATT CATAG GTATAG TTAA AATT -3’ -3’ -3’ -3’ -3’ 5’--5’ -5’ -5’ 5’- 3’- 5’- 3’-TRAWIENIE I LIGACJA WYPE£NIENIE CHROMOSOM REGION SUBTELOMEROWY TELOMER
REGION 3’ BOGATY W GUANINÊ SEKWENCJE OLIGO
Msel Ndel Msel
PRODUKTY PCR
Rycina 16.4: Schemat przedstawiaj ˛acy kolejne etapy metody STELA, wg [14].
16.3.1. Q-PCR i MMQ-PCR (ang. Monochrome Multiplex Quantitative
Method in Real Time PCR)
Obie te metody s ˛a szeroko stosowane w badaniach klinicznych i epidemio-logicznych z uwagi na sw ˛a czuło´s´c, wysok ˛a dost˛epno´s´c i przepustowo´s´c reak-165
16. Współczesne technologie identyfikacji długo´sci telomerów
cji [16, 17]. Podczas amplifikacji w przebiegu reakcji PCR wykorzystuje si˛e nie-dopasowanie długo´sci ko ´nców telomerów bogatych zarówno w zasady C i G. Te dysproporcje w długo´sci zmniejszaj ˛a formowanie dimeru i adaptacj˛e w postaci
wzmocnienia wyst˛epuj ˛acego tylko na telomerach w dwóch pierwszych cyklach
PCR dla niskich temperatur. Pozostałe cykle PCR prowadzi si˛e w wy˙zszej tempe-raturze, wzmocnienie mierzy si˛e ilo´sciowo dla długo´sci telomeru (T) w porów-naniu do pojedynczego kopiowania genu (S). Wygenerowane proporcje T/S od-zwierciedlaj ˛a odpowiednie długo´sci telomeru np. od 0.6 do 1.9 dla krwi pełnej u zdrowych, 0.99 u pacjentów z uszkodzonym szpikiem, 6.44 w komórkach po-liczka [17].
16.3.2. Q-FISH (ang. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization) Metoda wykorzystuje sondy specyficzne dla peptydu kwasu nukleinowego (PNA), o wysokim powinowactwie do DNA, bezpo´srednie znakowanie fluore-scencyjne dla chromosomów metafazalnych [18]. Fluorescencyjny sygnał mo˙ze zosta´c wykrywany i mierzony wzgl˛edem znanych standardów chromosomu. Dłu-go´s´c telomeru w metafazie oceniana jest z wykorzystaniem oprogramowania Q-FISH (analiza obrazuwww.flintbox.com). Q-FISH jest metod ˛a pozwalaj ˛ac ˛a na jednoczesne kariotypowanie. Do uzyskania wiarygodnego wyniku wymaga ana-lizy 15-20 metafaz. Q-FISH jest równie˙z wykorzystywany do wykrywania ko ´nców chromosomów bez wykrywalnych powtórze ´n (<0,5 kb), jak równie˙z do analizy fuzji chromosomów. Technika ta jest wykorzystywana do badania długo´sci telo-merów, w wielu sytuacjach klinicznych, w których mamy do czynienia z analiz ˛a komórek wyst˛epuj ˛acych rzadko. Q-FISH mo˙ze sprawia´c trudno´sci przy identyfi-kacji typów komórek z bardzo niskimi wska´znikami mitotycznymi [19].
16.3.3. Flow-FISH (ang. Flow Fluorescence in situ Hybridization) Podobnie do Q-FISH, ta metoda wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie sondy peptydowe (CCCTAA) 3 kwasu nukleinowego (PNA). W metodzie
anali-zowane s ˛a komórki ˙zywe z wykorzystaniem techniki cytometrii przepływowej
[20–22]. Flow-FISH mo˙zna wykorzysta´c do pomiaru długo´sci telomerów w mie-szanych populacjach komórek, w pojedynczej próbce przez barwienie specyficz-nymi przeciwciałami lub najdogodniej w populacji komórek sortowanych.
Wyko-rzystanie techniki Flow-FISH udokumentowano w badaniu pacjentów z anemi ˛a
aplastyczn ˛a, u których zaobserwowano korelacj˛e pomi˛edzy długo´sci ˛a telomerów
w granulocytach a odpowiedzi ˛a na immunosupresyjne leczenie [23]. Wykazano
równie˙z, ˙ze utrata telomerowych powtórze ´n w komórkach hematopoetycznych
dotyczyła pierwszego roku po alogenicznym przeszczepieniu szpiku [24]. Me-tod˛e Flow-FISH zastosowano jako meMe-tod˛e diagnostyczn ˛a do potwierdzenia kli-nicznego dyskeratosis congenita, choroby zwi ˛azanej ze zmianami genetycznymi w podjednostce telomerazy [20]. Okre´slono te˙z ´sredni ˛a długo´s´c telomerów w gra-nulocytach, naiwnych komórkach T, komórkach T pami˛eci, oraz limfocytach B i NK w ludzkiej krwi [25].
16.4. Wykorzystanie metod okre´slaj ˛acych długo´s´c telomerów