Przedtransplantacyjna identyfikacja alloprzeciwciał

Dokładne przedtransplantacyjne okre´slenie przeciwciał pozwala przewidzie´c reaktywno´s´c biorcy na dawc˛e. Porównanie zgodno´sci tkankowej wykonywane jest w zakresie antygenów HLA z loci A, B, DR. Jednak˙ze immunologiczna utrata przeszczepu przez biorców z grupy podwy˙zszonego ryzyka immunologicznego przy pełnej zgodno´sci w tych antygenach wskazuje na rol˛e przeciwciał anty HLA –Cw, -DQ, -DP i konieczno´s´c doboru w rozszerzonym zakresie HLA [9].

6.2.1. Testy komórkowe

Pierwsz ˛a metod ˛a umo˙zliwiaj ˛ac ˛a wykrycie przeciwciał anty-HLA była cyto-toksyczno´s´c zale˙zna od komplementu (ang. complement dependent cytotoxicity, CDC), w której komórkami docelowymi dla przeciwciał IgG i IgM wi ˛a˙z ˛acych do-pełniacz s ˛a limfocyty. Test CDC u˙zywany jest przy badaniu obecno´sci przeciwciał anty-HLA, niestety nie pozwala na identyfikacj˛e ich swoisto´sci. Mimo powszech-nego nadal zastosowania, wi ˛a˙ze si˛e z nim kilka problemów. Zale˙zy od zmiennego panelu limfocytów, a na swoisto´s´c i czuło´s´c testu wpływa ˙zywotno´s´c komórek i jako´s´c króliczego komplementu. ´Zródłem limfocytów jest krew obwodowa. Ni-ski odsetek limfocytów B sprawia, ˙ze wykrycie obecno´sci przeciwciał anty-HLA klasy II mo˙ze by´c trudne. Równocze´snie nale˙zy pami˛eta´c, ˙ze wykrywane s ˛a prze-ciwciała wi ˛a˙z ˛ace komplement, które nie zawsze s ˛a HLA swoiste. Wyniki testu CDC przedstawiane s ˛a jako odsetek komórek panelu, z którymi surowica reaguje

(% PRA). Odsetek PRA CDC oznacza prawdopodobie ´nstwo znalezienia

wła´sci-wego dawcy – im wy˙zszy, tym mniejsza szansa na przeszczep. Przy mało zró˙z-nicowanym panelu limfocytów wzorcowych wynik testu nie odzwierciedla praw-dziwego stopnia immunizowania chorego. Do tego doł ˛acza si˛e problem fałszywie

pozytywnych wyników z powodu autoprzeciwciał daj ˛acych 100% PRA, a

praw-dopodobnie nieistotnych dla losów przeszczepu (20). W te´scie CDC autoprze-ciwciała mog ˛a by´c usuni˛ete przez absorpcj˛e z autologicznymi limfocytami i/lub dodanie dithiothreitolu (DTT) w celu usuni˛ecia przeciwciał klasy IgM. Dodanie DTT umo˙zliwia usuni˛ecie fałszywie pozytywnych autoreaktywnych przeciwciał IgM, jakkolwiek mo˙ze to spowodowa´c równie˙z usuni˛ecie przeciwciał IgM allore-aktywnych. Wymienione powy˙zej ograniczenia oznaczaj ˛a, ˙ze stopie ´n uczulenia pacjenta nie powinien by´c okre´slany tylko w oparciu o odsetek PRA CDC.

Czulsz ˛a metod ˛a komórkow ˛a jest cytometria przepływowa. Test oznaczania alloprzeciwciał na cytometrze przepływowym wykorzystuje pul˛e komórek

zapro-6.2. Przedtransplantacyjna identyfikacja alloprzeciwciał jektowanych tak, by pokrywały wszystkie główne swoisto´sci HLA i serologicznie krzy˙zowo – reaguj ˛ace grupy. Wykorzystano do tego celu limfocyty od chorych na przewlekł ˛a białaczk˛e limfatyczn ˛a (CLL) komórki limfoblastyczne z linii komór-kowych, które były zainfekowane EBV, a tak˙ze limfocyty krwi obwodowej. Ozna-czanie surowic w cytometrze z pojedynczymi panelami komórek jest niewygodne na du˙z ˛a skal˛e, wobec tego opcj ˛a jest pulowanie komórek, co pozwala na badanie wi˛ekszej liczby surowic w krótszym czasie i jest czulsze ni˙z CDC. Surowice dodat-nie mog ˛a by´c nast˛epnie badane pod k ˛atem swoisto´sci w cytometrze przy u˙zyciu pojedynczych paneli komórkowych. U˙zycie linii komórkowych z ekspresj ˛a poje-dynczych antygenów HLA w cytometrze przepływowym umo˙zliwia identyfikacj˛e antygenów HLA na które pacjent nie ma przeciwciał [10].

6.2.2. Testy fazy stałej

Testy fazy stałej z u˙zyciem oczyszczonych, rekombinowanych cz ˛asteczek HLA umieszczonych na dnie studzienki lub powierzchni polistyrenowych mikroku-lek w znacz ˛acy sposób poprawiły wykrywanie i charakterystyk˛e alloprzeciwciał

u pacjentów immunizowanych. Nie wymagaj ˛a ˙zywych limfocytów, przeznaczone

s ˛a do wykrywania przeciwciał swoistych dla HLA. Do wykonania bada ´n stoso-wany jest fluorymetr przepływowy (Luminex), cytometr przepływowy lub czyt-nik ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Testy ELISA po raz pierwszy wprowadzono w latach 90-tych . Testy umo˙zliwiaj ˛a ocen˛e obecno´sci lub braku przeciwciał oraz okre´slenie ich swoisto´sci. Czuło´s´c testów ELISA jest wy˙zsza ni˙z CDC, ale ni˙zsza ni˙z w cytometrii przepływowej [11]. Współcze´snie najczulszy jest test X-Map Luminex, umo˙zliwiaj ˛acy wykrywanie nawet niskich st˛e˙ze ´n przeciw-ciał anty-HLA. Metoda ta jest poł ˛aczeniem techniki multipleksowej (fluorescen-cyjne mikrokulki pokryte oczyszczonymi antygenami HLA klasy I lub II) z tech-nik ˛a cytometrii przepływowej. Wysoka czuło´s´c metody wymaga dodatkowo okre-´slenia, które z wykrywanych przeciwciał s ˛a wa˙zne klinicznie. Bezwzgl˛edna ocena warto´sci MFI (ang. median fluorescent intensity) nie jest wła´sciwym parametrem, poniewa˙z wykazano, ˙ze ró˙znica w nat˛e˙zeniu fluorescencji mo˙ze by´c zale˙zna od partii odczynnika [12]. Badania wskazuj ˛a, ˙ze klinicznie wa˙zne s ˛a przeciwciała ak-tywuj ˛ace klasyczn ˛a drog˛e układu dopełniacza. C1q jest pierwsz ˛a składow ˛a ak-tywacji układu dopełniacza, czego ostatecznym skutkiem s ˛a złogi C4d wykry-wane immunohistochemicznie w odrzucanej tkance. Wydaje si˛e, ˙ze test C1q-SAB (ang. Single Antigen Bead) z wysok ˛a czuło´sci ˛a i swoisto´sci ˛a wykrywa wi ˛a˙z ˛ace komplement przeciwciała anty-HLA [13].

Po identyfikacji swoisto´sci przeciwciał anty-HLA u zimmunizowanego biorcy mo˙zna ustali´c nieakceptowane antygeny i porówna´c z wielotysi˛eczn ˛a baz ˛a da-nych o populacyjnej cz˛esto´sci wyst˛epowania okre´sloda-nych HLA, identyczda-nych w układzie AB0 dawca-biorca, (np. baza danych Eurotransplantu). Obliczona cz˛esto´s´c dodatnich reakcji wynikaj ˛acych z obecno´sci przeciwciał anty-HLA wyra-˙zana jest jako % niezgodnych dawców. W ten sposób mo˙zliwe jest uzyskanie in-formacji o prawdopodobie ´nstwie wyst ˛apienia dodatniej reakcji w populacji okre-´slanej jako wirtualne PRA (vPRA).

6. Identyfikacja przeciwciał anty-HLA ...

Testy identyfikuj ˛ace antygenowe swoisto´sci (ang. single antigen, SA) mog ˛a by´c szczególnie przydatne do badania profilu przeciwciał pacjenta w celu ustalenia najlepszych HLA dawcy, a tak˙ze przy monitorowaniu przeciwciał po ich przed-transplantacyjnym usuwaniu lub identyfikacji DSA – przeciwciał swoistych dla dawcy w okresie potransplantacyjnym (40). Współczesne testy umo˙zliwiaj ˛a iden-tyfikacj˛e na poziomie alleli [14] co oznacza, ˙ze wcze´sniej oznaczone swoisto´sci jako zgodne z dawc ˛a, mog ˛a skutkowa´c wykryciem przeciwciał zwi ˛azanych z od-mienno´sci ˛a alleliczn ˛a.

Technika Luminex „single antigen” umo˙zliwia dokładne definiowanie epito-pów i wskutek tego rozumienie reaktywno´sci przeciwciał. HLA Matchmaker jest komputerowym algorytmem, który porównuje zgodno´s´c HLA na poziomie struk-tury poprzez analiz˛e sekwencji tripletów aminokwasów lub strukturalnych zbio-rów aminokwasów [15]. Wykazano, ˙ze niezgodno´sci w tripletach koreluj ˛a z pro-dukcj ˛a przeciwciał wykrywanych przy u˙zyciu SA na Luminex-ie, a takie badanie pozwala ustali´c profil pacjenta uczulonego i zidentyfikowa´c nie tylko te epitopy HLA, przeciwko którym pacjent wytworzył przeciwciała, ale tak˙ze do których nie-zgodno´sci prawdopodobnie zareaguje.

Przy definiowaniu nieakceptowanych niezgodno´sci, czyli okre´slaniu antyge-nów HLA przeciwko którym pacjent ma przeciwciała, nale˙zy równie˙z uwzgl˛ed-ni´c niezgodne antygeny poprzednich przeszczepów, przeciwko którym nie wyka-zano przeciwciał. Nawet je´sli na bie˙z ˛aco przeciwciała nie s ˛a wykrywane, istnieje pami˛e´c immunologiczna, czego skutkiem mo˙ze by´c wtórna, przyspieszona reak-cja.

6.3. Próba krzy˙zowa

Celem wykonania próby krzy˙zowej (ang. cross-match, XM) jest ustalenie obec-no´sci przeciwciał anty dawca, czyli uzyskanie informacji o szacowanym ryzyku

immunologicznym. Wynik jest informacj ˛a o klinicznym znaczeniu najwy˙zszej

wagi i ocenia potencjalne ryzyko ka˙zdego przeszczepu. Wykazano, ˙ze przeciw-ciała anty AB0 i anty-HLA powoduj ˛a nadostre odrzucanie. Prospektywna próba krzy˙zowa mo˙ze wskaza´c pacjenta o wysokim ryzyku utraty przeszczepu i zdecy-dowa´c o odst ˛apieniu od transplantacji.

Najstarsz ˛a technik ˛a, nadal stosowan ˛a w diagnostyce rutynowej, jest test CDC [16]. Ju˙z w 1969 r. wykazano jego warto´s´c przewidywania nadostrego odrzu-cania. Metoda CDC wykrywa przeciwciała wi ˛a˙z ˛ace dopełniacz, zarówno swoiste jak i nieswoiste dla HLA. Czulsz ˛a technik ˛a pozwalaj ˛ac ˛a wykry´c w próbie krzy˙zo-wej przeciwciała anty dawca jest cytometria przepływowa (ang. flow cytometry cross match, FCXM ) [17]. Wad ˛a tej metody jest jednak zwi˛ekszony odsetek wyni-ków fałszywie dodatnich, zwi ˛azanych z wykryciem przeciwciał nieistotnych kli-nicznie. Próby wykonywania XM w oparciu o testy fazy stałej np. X-Map Luminex nie uprawniaj ˛a jeszcze do ich szerokiego u˙zycia [18].

Surowica do próby krzy˙zowej pobrana przed przeszczepem odzwierciedla bie-˙z ˛acy status uczulenia przeciw dawcy. Je´sli wiadomo, ˙ze nie było incydentu uczu-laj ˛acego, mo˙zna akceptowa´c surowice pobrane wcze´sniej, ale nie starsze ni˙z