MACIERZYSTYCH
Urszula SiekieraRegionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa Katowice Pracownia Immunogenetyki Układu HLA
Streszczenie
Komórki macierzyste jako samoodtwarzaj ˛ace si˛e progenitorowe komórki wy-specjalizowanych tkanek odpowiadaj ˛a za odnow˛e tego co w zwykły sposób zo-stało zu˙zyte, jak równie˙z tego co zozo-stało uszkodzone. Komórki macierzyste zna-lazły zastosowanie w wielu dziedzinach medycyny regeneracyjnej. Przeszczepie-nie macierzystych komórek hematopoetycznych obejmuj ˛ace transplantacj˛e szpiku stanowi jedn ˛a z najcz˛e´sciej stosowanych metod leczenia chorób układu krwiotwór-czego. Immunogenno´s´c komórek macierzystych embrionalnych jak równie˙z soma-tycznych jest krytycznym czynnikiem doboru dawcy oraz biorcy przeszczepu. Sce-nariusz immunogenno´sci alogenicznych komórek macierzystych to polimorfizm głównego kompleksu zgodno´sci tkankowej. Biologiczna funkcja układu zgodno´sci tkankowej sprawia, i˙z układ ten stanowi centrum fazy inicjacji jak równie˙z fazy efek-torowej odpowiedzi immunologicznej.
Słowa kluczowe: komórki macierzyste, główny kompleks zgodno´sci tkankowej,
przeciw-ciała anty-HLA
4.1. Wst˛ep
Konsekwencje immunologiczne wynikaj ˛ace z ró˙znicy genetycznej głównego
kompleksu zgodno´sci tkankowej (ang. major histocompatibility complex, MHC) dawcy i biorcy bardzo dobrze poznane w transplantacji narz ˛adowej odnosz ˛a si˛e w du˙zym stopniu do transplantacji komórek macierzystych [1]. Mechanizm od-rzucenia przeszczepu mediowany obecno´sci ˛a przeciwciał (ang. antibody media-ted rejection, AMR) polegaj ˛acy na interakcji przeciwciał biorcy z niezgodnym an-tygenem HLA dawcy jest główn ˛a barier ˛a immunologiczn ˛a transplantacji narz ˛ a-dowej oraz komórkowej. Sytuacja jest szczególnie gro´zna kiedy w czasie
trans-4. Identyfkacja przeciwciał anty-HLA u chorych ...
plantacji w surowicy biorcy obecne s ˛a przeciwciała klasy IgG wi ˛a˙z ˛ace dopełniacz
skierowane do antygenów układu HLA dawcy. Pocz ˛atkowo uwa˙zano ich komórki
macierzyste nie s ˛a immunogenne. Pogl ˛ad ten został jednak w znacznym stop-niu zweryfikowany natomiast dogmat immunologicznego uprzywilejowania ko-mórek macierzystych został odrzucony. Wcze´sniejsze przewidywania niskiej
im-munogenno´sci komórek macierzystych odnosz ˛a si˛e jedynie do stadium
komó-rek niedojrzałych. Immunogenno´s´c komókomó-rek macierzystych autologicznych czy alogenicznych embrionalnych czy dorosłych stanowi w chwili obecnej problem istotny z punktu widzenia doboru przed przeszczepem. Wiele grup komórek ma-cierzystych wykazuje na swojej powierzchni słab ˛a ekspresj˛e molekuł MHC klasy I nie wykazuj ˛ac ekspresji MHC klasy II. Fakt ten wskazywa´c mógłby na immunolo-giczne uprzywilejowanie komórek macierzystych. Mimo i˙z komórki macierzyste nie wykazuj ˛a ekspresji MHC pocz ˛atkowo mog ˛a nabywa´c t˛e ekspresj˛e w mikro-´srodowisku poprzez kontakt z komórkami stromy, czynnikami wzrostu oraz biał-kami macierzy pozakomórkowego. Komórki macierzyste napotykaj ˛a wiele proza-palnych cytokin IFN-γ, TNF-α. Mikro´srodowisko oraz jego elementy razem lub z osobna moduluj ˛a ekspresj˛e molekuł MHC wyst˛epuj ˛acych na powierzchni ko-mórek macierzystych. Komórki macierzyste zachowuj ˛ac ich podstawowe funkcje nabywaj ˛a ekspresj˛e HLA-DR i mog ˛a prezentowa´c antygen. Biorcy komórek ma-cierzystych mog ˛a posiada´c przeciwciała anty-HLA cz˛e´sciej ni˙z dot ˛ad
przypusz-czano. Mog ˛a to by´c przeciwciała skierowane do antygenu dawcy (ang. donor
sensitive antibodies, DSA) lub te˙z przeciwciała skierowane do epitopów nie-HLA. Nie jest jak dot ˛ad całkowicie wyja´sniony problem DSA w przeszczepach komó-rek macierzystych. Wiadomo jednak, ˙ze układ odporno´sciowy biorcy rozpoznaje komórki macierzyste dawcy anga˙zuj ˛ac w to odpowied´z komórkow ˛a oraz humo-raln ˛a. Odpowied´z humoralna po transplantacji jest zwi ˛azana ze zmian ˛a niskoim-munogennego profilu poprzez zwi˛ekszenie lub zmian˛e immunokompetentno´sci cz˛esteczek MHC. Badania przedkliniczne wskazuj ˛a na zwi˛ekszenie odpowiedzi immunologicznej. Wy˙zsza ekspresja cz ˛asteczek MHC klasy I jak równie˙z klasy II przyczynia si˛e do produkcji przeciwciał anty-HLA. Gebel oraz Bray [2] wykazuj ˛a udział przeciwciał anty-HLA jako jeden z głównych czynników uszkadzaj ˛acych funkcj˛e przeszczepu. Dodatkowym problemem jest fakt, i˙z cz˛esto wielu bior-ców otrzymuje niezupełnie zgodne pod wzgl˛edem układu HLA komórki macie-rzyste. St ˛ad wydaje si˛e bardzo istotne identyfikowanie przeciwciał skierowanych do antygenów układu HLA jak równie˙z monitorowanie obecno´sci przeciwciał po dokonanej transplantacji. Celem niniejszej pracy jest identyfikacja przeciwciał anty-HLA u chorych, u których dokonano transplantacji komórek macierzystych
4.2. Metodyka
Identyfikacja przeciwciał skierowanych do antygenów układu HLA klasy I jak równie˙z klasy II wykonana została w grupie osób wymagaj ˛acych transplantacji szpiku. Surowic˛e krwi która stanowiła materiał do bada ´n pobrano przed prze-szczepem (66 osób), w 30 dobie po dokonanej transplantacji (43 osoby), w 100 dobie po transplantacji (45 osób) oraz rok po przeszczepie (38 osób). Badana
4.3. Wyniki grupa chorych to biorcy hematopoetycznych komórek macierzystych niezgodni z dawc ˛a w układzie HLA. Niezgodno´s´c dotyczyła locus A, locus B, locus C, locus DQB1, locus DRB1 odpowiednio w 17, 10, 24, 11, 1 przypadkach. U trzech z ba-danych osób niezgodno´s´c dotyczyła locus B oraz locus C. Badania prowadzono w okresie od 2007 do 2011 roku. Identyfikacj˛e przeciwciał przeprowadzono stosu-j ˛ac dwie techniki Procesor DynaChip oraz technik˛e identyfikacji przeciwciał Lab-Screen w systemie LUMINEX. Stosowane techniki pozwoliły na okre´slenie obec-no´sci przeciwciał skierowanych do antygenów układu HLA poprzez wyliczenie warto´sci PRA. Stosowane metody identyfikacji przeciwciał pozwoliły na okre´sle-nie klasy jak rówokre´sle-nie˙z swoisto´sci przeciwciał. Stosowana technika LabScreen po-zoliła na identyfikacj˛e przeciwciał skierowanych do okre´slonego antygenu HLA klasy I oraz do okre´slonego antygenu układu HLA klasy II. Technika stosowana bardzo powszechnie w transplantacji narz ˛adowej [3].
4.3. Wyniki
Identyfikacja przeciwciał skierowanych do antygenów układu HLA przepro-wadzona przed transplantacj ˛a wykazała u 35 osób ( 53%) obecno´s´c przeciwciał skierowanych do antygenów układu HLA . W grupie 19 osób (28,79%) identy-fikowane przeciwciała skierowane były do antygenów układu HLA klasy I oraz HLA klasy II. Obecno´s´c przeciwciał skierowanych tylko do antygenów HLA klasy I wykazano u 8 osób (12,12%). Tak samo liczna była grupa chorych, u których identyfikowano przeciwciała skierowane tylko do antygenów układu HLA klasy II (12,12%). U 31 osób (46,97%) nie stwierdzono obecno´sci przeciwciał anty HLA. Identyfikacja przeciwciał anty-HLA przeprowadzona w surowicy krwi pobranej w 30 dobie po transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych wy-kazywała obecno´s´c przeciwciał skierowanych do antygenów układu HLA klasy I u 3 osób (6,97%), do antygenów ukladu HLA klasy II u 6 osób (13,95%), przeciw-ciała anty-HLA skierowane do obu klas u 14 osób (32,56%) u 20 osób (46,52%) nie stwierdzono obecno´sci przeciwciał. Wyniki bada ´n kolejnego etapu analizy prze-prowadzonej w surowicy krwi pobranej w 100 dobie po transplantacji wskazuj ˛a na obecno´s´c przeciwciał anty-HLA klasy I oraz klasy II u 11 osób (24,44%), 6 osób (13,33%) badanej grupy wykazywała obecno´s´c przeciwciał skierowanych do an-tygenów układu HLA klasy II natomiast w grupie 10 osób (22,23%) stwierdzono obecno´s´c przeciwciał skierowanych do antygenów układu HLA klasy I. Pozostale 18 osób (40%) nie wytworzyło przeciwciał anty-HLA. Badania wykonane rok po transplantacji wykazały obecno´s´c przeciwciał u 17 badanych osób (44,74%) na-tomiast surowice 21 osób były ujemne (55,26%). Przeciwciała skierowane do an-tygenów układu HLA klasy I wytworzyło 15,78 % osób przeciwciała skierowane do antygenów układu HLA klasy II 21,1% osób. Tylko w 3 przypadkach identy-fikowano przeciwciała skierowane zarówno do klasy I jak i klasy II układu HLA stanowiło to 7,86% badanych w tym okresie osób.
Istotnym elementem prowadzonej analizy było sprawdzenie swoisto´sci wy-twarzanych przeciwciał anty-HLA w odniesieniu do niezgodno´sci w układzie HLA dawcy oraz biorcy przeszczepu. W przypadku niezgodno´sci dotycz ˛acej locus A 55
4. Identyfkacja przeciwciał anty-HLA u chorych ...
badanie surowicy pobranej w 30 dobie po przeszczepie identyfikowane przeciw-ciała skierowane były zarówno do pierwszej jak równie˙z do drugiej klasy anty-genów układu HLA. W surowicach pobranych w okresie pó´zniejszym to znaczy w 100 dobie po transplantacji oraz 1 rok po transplantacji identyfikowano głów-nie przeciwciała skierowane do antygenów układu HLA klasy I. Na uwag˛e zasłu-guje fakt i˙z w przypadku niezgodno´sci dotycz ˛acej locus A obserwowano znaczne ró˙znice w oszacowanych warto´sciach PRA w przypadku niektórych niezgodnych alleli A*03:02/A*03:01 (PRA 1,5%) A*02:05/A*02:01 (60,5%). ´Sledz ˛ac identyfiko-wane przeciwciała oraz niezgodno´sci dotycz ˛ace locus B obserwowano niskie war-to´sci PRA. W grupie badanych osób niezgodno´s´c dawcy i biorcy zwi ˛azana z regio-nem HLA-C jest najcz˛e´sciej obserwowana. W grupie tej identyfikowano przeciw-ciała o swoisto´sci anty-HLA kasy I oraz anty-HLA klasy II. Szacowane warto´sci PRA mieszcz ˛a si˛e w granicach 6-20% w przypadku przeciwciał skierowanych do antygenów układu HLA klasy I oraz 15-95% w przypadku przeciwciał skierowa-nych do antygenów układu HLA klasy II. W grupie badaskierowa-nych osób niezgodskierowa-nych z dawc ˛a w locus DQ rzadziej w porównaniu do pozostałych niezgodno´sci identyfi-kowano przeciwciała anty-HLA. Szacowane warto´sci PRA zawierały si˛e w granicy 2-5%.
W badanej grupie cenna wydaje si˛e identyfikacja swoisto´sci wytwarzanych przeciwciał. Identyfikacja przeciwciał skierowanych do pojedynczego antygenu przeprowadzona technik ˛a LabScreen w systemie LUMINEX pozwoliła na okre´sle-nie swoisto´sci przeciwciał anty HLA klasy I jak rówokre´sle-nie˙z anty HLA klasy II. Identy-fikowane przeciwciała okre´slono na poziomie niskiej oraz wysokiej rozdzielczo´sci nie obserwowano zbie˙zno´sci miedzy niezgodnym allelem układu HLA a swoisto-´sci ˛a wytwarzanych przeciwciał.
4.4. Podsumowanie
Przeprowadzone badania wskazuj ˛a na istot˛e problemu identyfikacji przeciw-ciał anty-HLA oraz monitorowanie obecno´sci przeciwprzeciw-ciał z punktu widzenia transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych. Liczna jest grupa chorych, u których wykazano obecno´s´c przeciwciał jeszcze przed dokonanym przeszczepem. Ocena wpływu obecno´sci przeciwciał identyfikowanych przed transplantacj ˛a na przebieg zabiegu oraz leczenia wydaje si˛e by´c bardzo pomocna dla przeprowadzanej transplantacji. W badanej grupie osób obserwowano zró˙z-nicowany poziom produkcji przeciwciał mo˙zliwy do oceny po oszacowaniu war-to´sci PRA. Badania przeprowadzone w aspekcie identyfikacji swoiswar-to´sci wytwa-rzanych przeciwciał wydaja si˛e by´c warte kontynuacji. Wprawdzie nie wykazano bezpo´sredniej zale˙zno´sci pomi˛edzy niezgodno´sci ˛a dawca/biorca oraz swoisto-´sci ˛a wytwarzanych przeciwciał nale˙zało si˛e tego jednak spodziewa´c maj ˛ac na uwadze polimorfizm układu zgodno´sci tkankowej. Dalsza analiza identyfikowa-nych przeciwciał odniesiona do budowy molekularnej niezgodidentyfikowa-nych alleli wydaje si˛e by´c pomocna w wyznaczeniu wspólnego mianownika pomi˛edzy niezgodno-´sci ˛a dawca/biorca a aktywno´sci ˛a odpowiedzi humoralnej.
4.4. Podsumowanie
Literatura
[1] Charron D., Suberbielle-Boissel C., Tamuza R., Al.-Daccak R.: Anti-HLA antibodies in regenerative medicine stem cell therapy. Hum Immunol 2012; in press
[2] Goebel H.M., Bray R.A.: Approaches for transplanting the sensitized patient: biology versus pharmacology, Nefrol Dial Transplant, 2008; 23(8): 2454-2457
[3] Cecka J.M.: Current methodologies for detecting sensitization to HLA antigens Curr Opin Organ Transplant 2011; 16: 398
R O Z D Z I A Ł