Znaczenie kliniczne

II) [1,3]. Liczbowy pomiar fluorescencji zwi˛eksza obiektywizm interpretacji w po-równaniu do półilo´sciowej oceny stosowanej w te´scie mikrolimfocytotoksycz-nym.

Wykorzystanie trzech kolorów fluorescencji pozwala na zmniejszenie liczby limfocytów o połow˛e w stosunku do badania z wykorzystaniem mniejszej liczby fluorescencji. Jest to szczególnie istotne przy badaniu komórek pochodz ˛acych z krwi obwodowej, w której limfocyty B stanowi ˛a zaledwie 10-15%. Wykazano, ˙ze badanie trzykolorowe jest te˙z około 30% ta ´nsze od dwukolorowego, wobec mniej-szego zu˙zycia odczynników, a jego analiza trwa około 25% krócej ni˙z przy barwie-niu z wykorzystaniem dwóch kolorów [7].

Według ró˙znych autorów badanie cytometryczne jest 30 - 250 razy bardziej czułe od testu cytotoksycznego, co mo˙ze stanowi´c wyja´snienie dlaczego 18 - 25% pacjentów z ujemnym wynikiem próby krzy˙zowej z u˙zyciem dopełniacza ma do-datni wynik FCXM [8].

Wysoka czuło´s´c mo˙ze by´c te˙z wad ˛a. Badanie nie ma charakteru czynno´scio-wego i mo˙ze wykrywa´c przeciwciała swoiste dla dawcy narz ˛adu, lecz niepowo-duj ˛ace skutków patologicznych dla przeszczepionego narz ˛adu. Fałszywie do-datnie wyniki mog ˛a by´c spowodowane m.in. wysok ˛a autofluorescencj ˛a (co do-tyczy szczególnie limfocytów B), obecno´sci ˛a autoprzeciwciał, przeciwciał swo-istych dla antygenów innych ni˙z HLA lub nieswoistym wi ˛azaniem przeciwciała skoniugatowanego z fluorescein ˛a do receptorów Fc [3]. Jedn ˛a z głównych wad metody jest jednak brak standaryzacji, szczególnie w sposobie definiowania reak-cji dodatniej i ujemnej. Okre´slenie poziomu fluorescenreak-cji reprezentuj ˛acej reakcj˛e dodatni ˛a jest subiektywne i ró˙zni si˛e pomi˛edzy laboratoriami. Ka˙zdy zatem o´sro-dek musi opracowa´c strategie interpretacji by zredukowa´c odsetek reakcji fałszy-wie dodatnich.

8.12. Znaczenie kliniczne

Pomimo coraz bardziej nowoczesnej immunosupresji odrzucanie

przeszcze-pionego narz ˛adu pozostaje wa˙znym problemem w transplantologii. Na

po-wierzchni komórek obecne s ˛a antygeny zgodno´sci tkankowej kodowane przez

najbardziej polimorficzny układ genów w ludzkim organizmie, jakim jest główny kompleks zgodno´sci tkankowej, ale tak˙ze liczne inne białka o wła´sciwo´sciach an-tygenowych. Znaczenie przeciwciał produkowanych w odpowiedzi na immu-nizacj˛e tymi antygenami pozostaje cz˛esto nieznane. Wyniki bada ´n obejmuj ˛ace wiele tysi˛ecy przeszczepionych nerek wskazuj ˛a, ˙ze pozytywny wynik próby krzy-˙zowej z co najmniej jednym rodzajem komórki docelowej (limfocyty T i/lub B) wi ˛a˙ze si˛e z wi˛eksz ˛a cz˛esto´sci ˛a epizodów odrzucania w ci ˛agu pierwszego roku po przeszczepieniu [9–11] i gorszym prze˙zyciem przeszczepu w porównaniu do pa-cjentów, u których nie stwierdzono obecno´sci przeciwciał swoistych dla dawcy [6, 12, 13]. Z tego wzgl˛edu w wielu o´srodkach uwa˙za si˛e, ˙ze metoda nadaje si˛e do przewidywania długotrwałego prze˙zycia alloprzeszczepu i odpowiedniego mo-dyfikowania stosowanej immunosupresji.

8. Próba krzy˙zowa analizowana metod ˛a cytometrii przepływowej

Wydaje si˛e, ˙ze szczególne znaczenie mo˙ze mie´c klasa wykrywanych przeciw-ciał. W przewa˙zaj ˛acej liczbie laboratoriów wykonuje si˛e badania słu˙z ˛ace wykry-ciu przeciwciał klasy IgG. Pogl ˛ady na temat znaczenia klinicznego przeciwciał in-nych klas s ˛a bardzo rozbie˙zne. Przeciwciałom klasy IgM przypisywano znacze-nie korzystne [14] lub wr˛ecz przeciwznacze-nie – negatywny wpływ na czynno´s´c i prze-˙zycie przeszczepionej nerki [12]. Nale˙zy pami˛eta´c, ˙ze przeciwciała klasy IgM s ˛a bardzo heterogenne: mog ˛a by´c naturalne, lub te˙z powstawa´c we wczesnej fazie odpowiedzi immunologicznej po kontakcie z obcym antygenem - w obu przy-padkach wykazuj ˛a zdolno´s´c do wi ˛azania antygenów i dopełniacza [15]. Ostatnio coraz cz˛e´sciej uwa˙za si˛e, obecno´s´c przeciwciał klasy IgM mo˙ze stanowi´c czynnik ryzyka dla czynno´sci nerki przeszczepionej [9, 13, 16], szczególnie w przypadku

udokumentowanego przeł ˛aczenia produkowanych klas immunoglobulin z IgM

na IgG [15, 16]. Nie ma natomiast danych, by przeciwciała klasy IgA, cho´c zdolne do aktywacji dopełniacza na drodze alternatywnej, wykazywały szkodliwe dzia-łanie wobec przeszczepu nerki [17]. Dlatego zaniechano dalszych bada ´n nad ich wpływem na przeszczepy nerek.

8.13. Podsumowanie

Pomimo ogromnego post˛epu w zakresie immunosupresji przewlekłe odrzu-canie jest główn ˛a przyczyn ˛a utraty czynno´sci alloprzeszczepu w perspektywie dłu˙zszej ni˙z jednego rok. Wobec ostatnio coraz bardziej powszechnie akcepto-wanej teorii udziału przeciwciał w procesie przewlekłego odrzucania nakazuje to zwi˛ekszenie zainteresowania czułymi metodami ich wykrywania. Coraz bar-dziej powszechnie wykorzystywane techniki fazy stałej umo˙zliwiaj ˛ace wykrywa-nie przeciwciał anty-HLA wpłyn˛eły na znaczne zmwykrywa-niejszewykrywa-nie cz˛esto´sci wczesnej utraty przeszczepu. Próba krzy˙zowa analizowana z wykorzystaniem cytometrii przepływowej, wykonana z zachowaniem powy˙zej opisanych zasad, pozostaje

jednak wa˙znym i stosunkowo tanim narz˛edziem umo˙zliwiaj ˛acym wykrywanie

swoistej dla dawcy immunizacji przed przeszczepieniem.

Literatura

[1] Garavoy M.R., Rheinschmidt M.A., Bigos M. i wsp. Flow cytometry analysis: A high technology crossmatch technique facilitating transplantation. Transpl. Proc. 1983; 15: 1939-1944

[2] Bray R.A. Flow cytometry crossmatching for solid organ transplantation. Methods Cell Biol. 1994; 41: 103-119

[3] Horsburgh T, Martin S, Robson A. The application of flow cytometry to histocompa-tibility testing. Transpl. Immun. 2000; 8: 3-15

[4] Shenton B.K., Bell A.E., Harmer A.W. i wsp. Importance of methodology in the flow cytometric crossmatch: a multicentre study. Transpl. Proc. 1997; 29: 1454-1455 [5] Lobo P.I., Spencer P.E., Isaacs R.B., McCullough C. Hyperacute renal allograft

re-jection from anti-HLA class I antibody to B cells; antibody detection by two color FCXM was possible only after using pronase-digested donor lymphocytes. Transpl. Int. 1997; 10: 69-73

8.13. Podsumowanie [6] Graff R.J., Xiao H., Schnitzler M.A. i wsp. The role of positive flow cytometry

cros-smatch in late renal allograft loss. Hum. Immunol. 2009; 70: 502-505

[7] Robson A., Martin S. T and B cell crossmatching using three-colour flow cytometry. Transpl. Immunol. 1996; 4: 203-208

[8] Pi ˛atosa B., Rubik J., Grenda R. Is positive flow cytometric cross-match a risk factor for early cadaveric kidney graft dysfunction? Transpl. Proc. 2006; 38: 53-55

[9] Pi ˛atosa B., Kwiatkowska A., Rubik J., Jarmu˙zek W., Kluge P., Grenda R. The impact of donor-specific antibodies on graft outcome in pediatric renal transplantation from deceased donors. Ann. Transpl. 2011; 16 (4): 32-39

[10] Thiyagarajan U.M., Bagul A., Frost J., Horsburgh T., Nicholson M.L. Role of human leukocyte antigen, donor-specific antibodies, and their impact in renal transplanta-tion. Transpl. Proc. 2012; 44; 1231-1235

[11] Ho E.K., Vasilescu E.R., Colovai AI i wsp. Sensitivity, specificity and clinical relevance of different cross-matching assays in deceased-donor renal transplantation. Transpl. Immun. 2008; 20: 61-67

[12] Lentine K.L., Graff R.J., Xiao H. i wsp. Flow cytometry crossmatch before kidney transplantation in contemporary practice: target cell utilization, results patterns, ans associated lomg-term graft survival. Clin. Transpl. 2008; 253-266

[13] Graff R.J., Buchanan P.M., Dzebisashvili N. i wsp. The clinical importance of flow cytometry crossmatch in the context of CDC crossmatch results. Transpl. Proc. 2010; 42: 3471-3474

[14] Kerman R.H., Susskind B., Buyse I. i wsp.. Flow cytometry-detected IgG is not a con-traindication to renal transplantation: IgM may be beneficial to outcome. Transplan-tation 1999; 68: 1855-1858

[15] Lietz K., John R., Burke E. i wsp. Immunoglobulin M-to-immunoglobulin G anti-human leukocyte antigen class II antibody switching in cardiac transplant recipients is associated with an increased risk of cellular rejection and coronary artery disease. Circulation 2005; 112: 2468-2476

[16] Stastny P., Ring S., Lu C., Arenas J., Han M., Lavigna B. Role of immunoglobulin (Ig)-G and IgM antibodies against donor human leukocyte antigens in organ transplant recipients. Hum. Immun. 2009; 70: 600-604

[17] Doran T.J., Süsal C., Opelz G., Geczy A.F. IgA class antibodies and flow cytometric cross-matching in renal transplantation. Transplantation 1999; 67: 309-314

R O Z D Z